3. NỘI DUN G NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phân lập virus bằng phương pháp nuôi cấy virus trên phôi vịt và trên vịt con
trên vịt con
* Xử lý bệnh phẩm:
Bệnh phẩm là mẫu gan (Navet- V- NC) ựược nghiền nhỏ với nước sinh lý thành huyễn dịch 1/5 và xử lý kháng sinh (Penicillin, Streptomycin), ựể ở nhiệt ựộ 4oC trong 2 giờ. Mẫu gan ly tâm với tốc ựộ 5000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy huyễn dịch ở trên xử lý bằng clorofoc 5% trong 10 phút ựể diệt các virus khác không phải virus viêm gan vịt. Thu lấy nước trong và ựem cấy truyền trên phôi vịt ấp 13 ngày tuổị Trứng ựược ấp tiếp và theo dõi trong 6 ngàỵ Tiến hành mổ khám những phôi chết và thu nước trứng ở những phơi có biểu hiện bệnh tắch điển hình. Nước trứng này được gửi đơng khơ và bảo quản trong tủ lạnh âm sâu -86oC ựể tiếp tục nghiên cứụ
3.3.1.1 Phân lập virus trên phôi vịt * Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm được tiến hành 2 lần, mỗi lần tiêm cho 25 phơi/mẫu, có bố trắ 10 phơi làm đối chứng.
* Phương pháp gây nhiễm
- Chuẩn bị trứng: Trứng có phơi 13 ngày tuổi, soi trứng chọn những quả có phơi khoẻ mạnh. đánh dấu buồng hơi, vị trắ phơị Sát trùng toàn bộ phần vỏ bằng cồn 70o, sát trùng vùng buồng hơi bằng cồn iod 5%.
- Tiêm trứng: Tiêm trứng phải thực hiện trong buồng cấy vô trùng, trứng ựã sát trùng ựục 1 lỗ trên ựỉnh buồng hơi bằng dùi tiêm trứng. Dùng seringer 1ml hút nước trứng đã pha lỗng ở trên để tiêm, khi tiêm ựưa kim qua lỗ ựã dùi trên buồng hơi và chếch góc 45o, ựưa kim sâu vào 1,5 - 2cm hướng về phắa đầu phơi và bơm 0,2ml. Dùng parafin hàn kắn lỗ tiêm, để trứng vào khay và cho vào tủ ấm 37oC ấp tiếp.
Lơ đối chứng: khơng tiêm bệnh phẩm.
- Theo dõi trứng: Sau 18, 24, 48, 72, 96 giờ kiểm tra xem phơi trứng cịn sống hay đã chết. Những quả có phơi chết trong thời gian theo dõi và những thai sống sau 96 giờ cho vào tủ lạnh 4oC trong 8- 12 giờ. Sau đó mổ trứng thu nước trứng, gắp phơi ra đĩa lồng và kiểm tra bệnh tắch phơị Nước trứng này được gửi đơng khơ và bảo quản trong tủ lạnh âm sâu -86oC ựể tiếp tục nghiên cứụ
* Phương pháp nghiên cứu những biến ựổi bệnh lý của phôi
Biến đổi đại thể của phơi sau khi gây nhiễm.
- Phôi sau khi tiêm truyền giống virus ựem ấp tiếp và theo dõi ựến 144 giờ. Trong thời gian theo dõi, kiểm tra xem phơi cịn sống hay đã chết, nếu phơi đã chết thì ghi giờ chết và cho vào tủ lạnh 4oC. Sau 144 giờ cho toàn bộ trứng vào tủ lạnh 4oC/6-12 giờ. Mổ trứng, gắp phơi ra đĩa lồng và quan sát bệnh tắch.
- Phương pháp mổ trứng: Trứng lấy ra khỏi tủ lạnh, dùng khăn sạch lau hết nước bám xung quanh. Dùng cồn 70o sát trùng toàn bộ trứng, dùng cồn Iod 5% sát trùng vùng buồng hơị Lấy kéo cong vô trùng cắt vỏ trứng quanh buồng hơị Dùng pince phá vỡ màng phôi, gắp phơi ra đĩa lồng quan sát bệnh tắch.
- Bệnh tắch đại thể biểu hiện: phôi xuất huyết, phù phôi, gan phơi xuất huyết.... Những phơi có bệnh tắch ựặc trưng ựiển hình ở các nồng ựộ khác nhau, chúng tôi tiến hành chụp ảnh để ghi nhận bệnh tắch trong q trình làm.
3.3.1.2 Phân lập virus trên vịt con * Bố trắ thắ nghiệm
Mỗi lơ thắ nghiệm chúng tơi bố trắ 15 vịt trong đó 10 vịt thắ nghiệm, 5 vịt đối chứng. Thắ nghiệm được lặp lại 2 lần.
* Phương pháp nghiên cứu
- Giống virus : là nước trứng thu từ những phôi chết ở phần 3.3.1.1 có bệnh tắch điển hình của bệnh viêm gan vịt.
- Vịt 1 - 7 ngày tuổi khoẻ mạnh, không nằm trong ổ dịch và chưa miễn dịch với virus viêm gan vịt.
- Chúng tôi tiêm cho mỗi vịt 0,5ml huyễn dịch ựã pha vào bắp lườn và theo dõi vịt trong 10 ngày, quan sát những triệu chứng, mổ khám xác ựịnh bệnh tắch của những vịt chết ựể ựánh giá.
Nếu trong bệnh phẩm có virus, phơi trứng sẽ chết, khi lấy nước trứng của những phơi chết đó tiêm cho vịt con mẫn cảm, vịt con sẽ chết với triệu chứng lâm sàng và bệnh tắch đặc trưng của bệnh viêm gan vịt.
3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu những biểu hiện triệu chứng, bệnh tắch của vịt * Những triệu chứng và bệnh tắch đại thể
Vịt sau khi gây bệnh thì theo dõi trong 10 ngàỵ Quan sát những triệu chứng lâm sàng của vịt. Những vịt chết tiến hành mổ khám thu gan vịt, bảo quản và kiểm tra bệnh tắch. Tiến hành chụp ảnh những vịt có triệu chứng và bệnh tắch điển hình để ghi nhận q trình thắ nghiệm.