- Ở khoảng thời gian 2548 giờ:
4.2Kết quả giám ựịnh virus viêm gan vịt bằng kĩ thuật RT-PCR
để khẳng ựịnh chắc chắn ba mẫu nghiên cứu là virus cường ựộc viêm gan vịt, chúng tôi ựã sử dụng phương pháp hiện ựại và có ựộ tin cậy cao nhất hiện nay, ựó là sử dụng phương pháp sinh học phân tử, nhân ựoạn gen kháng nguyên VP1 (có ựộ dài khoảng 800 bp) bằng cặp mồi ựặc hiệu, sử dụng phản ứng PCR.
* Kết quả tách chiết RNA tổng số và thu nhận gen VP1
RNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm có thể bao gồm RNA hệ gen của virus và các loại RNA cấu trúc, RNA ựang hoạt ựộng (RNA thông tin, vận chuyển....) của tế bào và của virus. Mục ựắch của chúng ta là thu nhận ựược RNA hệ gen virus viêm gan vịt với hàm lượng cao, ựảm bảo ựủ làm khuôn cho phản ứng chuyển ựổi cDNA, từ ựó thực hiện phản ứng PCR thu nhận ựoạn gen.
Trong nghiên cứu này, RNA tổng số ựược tách chiết từ nước trứng nên có ựộ tinh khiết cao, ắt lẫn tạp các loại RNA của tế bào mà chủ yếu chỉ là RNA của hệ gen virus, do vậy, khi ựiện di kiểm tra chỉ nhìn thấy vệt RNA rất mờ, không thành vệt sáng ựậm như khi ựược tách từ mô.
Do virus viêm gan vịt có hệ gen là RNA, cho nên muốn nhân một ựoạn gen của nó thì trước hết người ta phải dùng phản ứng chuyển ựổi cDNA ựể chuyển ựổi RNA 1 sợi làm khuôn thành DNA 2 sợi nhờ sự xúc tác của một loại enzyme sao chép ngược (reverse Ờ transcriptase), enzym này có khả năng tổng hợp một sợi DNA mới ựối xứng bổ sung từ khuôn RNA theo chiều từ 5'->3' . Quá trình chuyển ựổi này ựược thực hiện ở 450C trong 30 phút và bất hoạt enzyme ựể ngừng phản ứng ở 720C trong 5 phút. Khi ựã có DNA 2 sợi làm khuôn chuyển ựổi từ RNA ban ựầu, giai ựoạn thứ hai dùng DNA 2 sợi này tiếp tục làm khuôn ựể thực hiện phản ứng PCR thông thường.
Chúng tôi ựã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệu là DHV1F Ờ DHV1R ựể nhân ựoạn gen kháng nguyên VP1 có ựộ dài 719 nucleotide từ vị trắ nucleotide thứ 2106 Ờ 2825, sử dụng chu trình nhiệt như ựã trình bàỵ Kết quả phản ứng ựược kiểm tra bằng cách chạy ựiện di trên thạch agarose 1% .
1 2 3 M
800 bp
516 bp2.0 kb 2.0 kb
Hình 4.7. Kết quả ựiện di sản phẩm PCR (~ 800 bp) của mẫu virus cường ựộc viêm gan vịt Navet- V- đT, Navet- V- AG và Navet- V- NC trên
thạch agarose 1%.