3. NỘI DUN G NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.4Phương pháp khảo sát tắnh tương đồng kháng ngun giữa chủng virus cường ựộc viêm gan vịt phân lập ựược và virus nhược ựộc viêm gan vịt
cường ựộc viêm gan vịt phân lập ựược và virus nhược ựộc viêm gan vịt chủng DH - EG - 2000 thơng qua phản ứng trung hịa trên phôi vịt
Tiến hành làm phản ứng trung hòa theo phương pháp huyết thanh cố ựịnh và virus pha loãng (Nguyễn Bá Hiên, 2010).
- Nguyên lý:
Trên ựối tượng nuôi cấy virus: phôi gà, phơi vịt, động vật cảm thụ, môi trường tế bào, virus sẽ nhân lên và gây bệnh tắch cho các đối tượng trên. Cịn khi phối hợp virus với kháng thể dịch thể ựặc hiệu tương ứng, virus sẽ bị trung hòa, khơng nhân lên được và khơng gây bệnh tắch.
để thực hiện phản ứng trung hòa cần phải chuẩn bị: + Huyết thanh miễn dịch chuẩn
+ Bệnh phẩm chứa virus chuẩn
+ Huyết thanh thường làm ựối chiếu (ựã xử lý ở 560C/30Ơ)
- Chuẩn bị:
+ Huyết thanh miễn dịch: vịt to 10 con, khỏe mạnh và chưa ựược tiêm vacxin. Tiêm vacxin Viêm gan vịt chủng DH - EG - 2000 cho chúng, tiêm 2 lần cách nhau 1 tuần sau 21 ngày lấy máu chắt huyết thanh.
+ Huyết thanh ựối chiếu: là huyết thanh thường ựược chắt từ vịt khỏe, không tiêm vacxin.
+ Chế huyết thanh: máu vịt ựược cho vào ống nghiệm vơ trùng, để máu tự đơng ở nhiệt độ phịng sau đó đưa vào tủ lạnh 40C ựể huyết thanh tách rạ Dùng seringe hút lấy phần huyết thanh bên trên đóng vào Ampoul ghi rõ xuất xứ của huyết thanh và bảo quản ở -200C cho ựến khi dùng.
Trước khi tiến hành thắ nghiệm huyết thanh được ựun ở 560C/30 phút ựể loại bỏ các yếu tố trung hịa khơng đặc hiệụ
+ Phôi vịt: trứng vịt giống ấp 370C ựến ngày thứ 13 ựem soi và chọn những phôi khỏe mạnh.
+ Giống VR: là nước trứng đã chuẩn bị ở trên.Pha lỗng virus thành các nồng ựộ 10-1 ọ 10-6 với nước sinh lý ựã xử lý kháng sinh.
+ Trộn huyết thanh miễn dịch và huyết thanh ựối chứng với các nồng ựộ virus đã pha lỗng theo tỉ lệ 1:1. Ủ hỗn hợp trên ở nhiệt ựộ 370C/1h.
- Tiến hành:
+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0.2ml/phôi), 5 phơi/nồng độ. Phơi được ấp tiếp ở tủ ấp 370C trong 10 ngàỵ Loại bỏ những phôi chết trước 24h.
Sơ ựồ phản ứng:
độ pha loãng virus Huyết thanh Số ống 10 - 1 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 5 10 - 6 Huyết thanh khơng pha lỗng, mỗi ống 0,2ml 1 2 3 4 5 6 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Phản ứng trung hịa phải có phản ứng đối chiếu kèm theo trong ựó huyết thanh miễn dịch ựược thay thế bằng huyết thanh bình thường.