3. NỘI DUN G NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2Giám ựịnh virus bằng phản ứng PCR
Virus chúng tôi phân lập ựược từ bệnh phẩm, ựể khẳng ựịnh chắc chắn ựó là virus viêm gan vịt chúng tôi sử dụng phản ứng RT-PCR.
* Phương pháp RT-PCR (Reverse Trancription- Polymeraze Chain Reaction)
Kĩ thuật RT-PCR ( hay còn gọi là phản ứng PCR ngược) là một phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khn RNA theo ngun lắ của phản ứng PCR bao gồm 2 giai ựoạn: giai ựoạn thứ nhất là chuyển ựổi một sợi RNA làm khn thành cDNA, sau đó qua giai đoạn thứ 2 dùng DNA hai sợi này làm khn để tiếp tục thực hiện phản ứng PCR.
Adenine, Guanine, Cytosine, Uracil. Chuỗi nucleotit này phải ựược chuyển ựổi thành DNA hai sợi, mà thành phần Uracil ựược thay thế bằng Thyminẹ Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ đến vai trị của enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase - RT). Do vậy, giai ựoạn này ựược gọi là giai ựoạn chuyển ngược. Khi đã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR.
Do vậy, giai ựoạn này gọi là giai ựoạn chuyển ngược (RT-Reverse Transcription). Khi đã có cDNA hai sợi làm khuôn, phản ứng tiếp theo là PCR. Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn DNA từ khn RNA qua hai giai đoạn nói trên được gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngược. Thay ựổi nhiệt ựộ ựể phù hợp cho mỗi chu kỳ. Có thể sử dụng phản ứng RT-PCR một bước hoặc hai bước.
Ớ Tiến hành
Mẫu ựem xét nghiệm là nước trứng của phôi vịt sau khi nuôi cấy virus từ bệnh phẩm. Mẫu virus cường độc này được kắ hiệu là Navet- V- NC, Navet- V-
đT và Navet-V-AG.
Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus:
RNA tổng số là toàn bộ RNA ựược tách chiết từ mẫu nghiên cứụ Muốn thu RNA thì cần phải loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng ựến hiệu quả RT-PCR. RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt ựộng (RNA thông tin, RNA vận chuyển) của tế bào và của virus. Mục đắch là thu nhận ựược RNA của hệ gen virus viêm gan vịt ựạt hàm lượng cao, ựảm bảo ựủ làm khuôn cho RT-PCR. Tuy nhiên, vì sử dụng cặp mồi ựặc hiệu cho virus khi thu nhận RNA tổng số làm khuôn nên dù lẫn các loại RNA khác thì vẫn thu ựược sản phẩm từ hệ gen virus.
Chúng tôi chiết tách RNA virus bằng bộ kit Ợ QIAamp viral kitỢ và sử dụng hóa chất do hãng QIAGEN cung cấp.
Tách virus viêm gan vịt ra khỏi vacxin bằng cách cho vào lọ vacxin 1,0 ml nước muối sinh lý 0,9 %, lắc ựều cho tan hết rồi chia ựều dịch vào 2 ống Eppendorf. Sau đó ly tâm 4.000vòng/phút, trong 10 phút. Sau ly tâm, thu dịch
trên vào 2 ống Eppendorf mới sau đó tiến hành tách chiết RNẠ
Qui trình thực hiện theo các bước:
- Bước 1: Hút 560 ộl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5 ml. - Bước 2: Thêm 140 ộl dung dịch mẫu ựã xử lý là nước trứng chứa virus vào ống Eppendorf trên, sau đó lắc ựều nhanh trong 15 giây rồi ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút.
- Bước 3: Thêm 560 ộl dung dịch Ethanol (96 - 100oC), lắc ựều nhanh trong 15 giâỵ
- Bước 4: Chuyển 630 ộl huyễn dịch trên sang cột QIAampspin. Li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nước dướị
- Bước 5: Lặp lại bước 4.
- Bước 6: Thêm 500 ộl dung dịch AW1, li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nước dướị
- Bước 7: Thêm 500 ộl dung dịch AW2, li tâm 13000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, bỏ nước dướị Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 13000vòng/phút, trong 1 phút.
- Bước 8: Chuyển cột sang một ống Eppendorf sạch mớị Thêm 60 ộl dung dịch AVE, để ở nhiệt độ phịng trong 1 phút. Sau đó li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dướị Dịch lỏng bên dưới chắnh là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở - 20oC.
Phản ứng chuyển ựổi cDNA của hệ gen virus
RNA hệ gen của virus ựược chuyển ựổi thành cDNA bằng enzyme Maxima Reverse Transcriptase (Fermentas), theo hướng dẫn của nhà sản xuất:
Q trình chuyển đổi được thực hiện ở 450C/30 phút, và kết thúc phản ứng ở 720C/5 phút. Sản phẩm cDNA ựược bảo quản ở -200C cho ựến khi sử dụng ựể thực hiện phản ứng PCR thu nhận gen VP1.
Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng PCR
DHV1F và mồi ngược DHV1R, được thiết kế dựa trên trình tự chuỗi gen của các chủng DHV đã được cơng bố trên Ngân hàng Gen, cho sản phẩm PCR khoảng 0,8 kilobase, chứa toàn bộ vùng gen VP1.
- Mồi xi: Kắ hiệu là DHV1F - Mồi ngược: Kắ hiệu DHV1R
Bảng 3.1. Các ựoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR
Tên mồi KH mồi Trình tự mồi (5Ỗ → 3Ỗ)
Mồi xuôi DHV1F AAG AAG GAG AAA ATY(C or T) AAGGAA GG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi ngược DHV1R TTG ATG TCA TAG CCC AAS(C or G) ACA GC
* Thành phần phản ứng PCR gồm: Thành phần Thể tắch (ộl) PCR master mix 25 Primer 1 (10pmol) 2 Primer 2 (10pmol) 2 DMSO 2.5 Khuôn cDNA 5 Nước 13,5 Tổng 50 *Chu trình PCR
Biến ựổi ựể tách sợi DNA mới thành 2 ựơn
(940C/30s)
Khuôn DNA ựược biến ựổi thành 2 sợi ựơn (940C/ 5 ph)
Gắn mồi vào ựầu ựoạn DNA(520C/30s)
Tổng hợp chuỗi DNA mới( 720C/ 1ph30s)
Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt: 940C/5 phút; 40 chu kỳ [940C/30 giây, 520C/30 giây, 720C/90 giây], và chu kỳ cuối cùng ở 720C/5 phút. Sau ựó bảo quản sản phẩm ở -200C cho ựến khi sử dụng.
Phương pháp ựiện di phát hiện sản phẩm PCR
Chuẩn bị agarose 1%
Cân một gram thạch agarose nguyên chất cho vào lọ thuỷ tinh chịu nhiệt. Thêm vào đó 100 ml đệm TAE 1 lần (1X TAE). Cho vào lị vi sóng và làm nóng chảy agarose trong 3 phút sao cho agarose tan chảy hết. Sau đó để nguội đến khoảng 600C. Rót khoảng 25-30 ml dung dịch agarose trên sang một cốc thuỷ tinh chịu nhiệt, bổ sung 4 ộl dung dịch Ethidium bromide (10mg/ml), lắc đều rồi ựổ vào hệ thống ựiện di có cài sẵn lược (tuỳ theo số lượng mẫu mà ta bố trắ lược có 8 hay 16 răng) và đổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm. để khoảng 60-120 phút cho thạch đơng, sau đó rút răng lược ra, các răng lược sẽ tạo thành các lỗ giếng ựể chúng ta tra mẫu vào điện dị
Dìm ngập khay có thạch trong buồng điện di chứa dung dịch ựệm TAE1X (ựệm TAE cung cấp ion cho ựiện trường hoạt ựộng).
Tra mẫu: Lấy 10 ộl sản phẩm PCR trộn với khoảng 2 ộl loading dye và
lần lượt tra riêng biệt vào các giếng riêng biệt.
Tra chỉ thị phân tử: Trong một giếng riêng biệt khác, cho 5 ộl chỉ thị phân tử
(chỉ thị phân tử là ADN của thực khuẩn thể Lamda ựược cắt bằng enzym Hind III).
Chạy ựiện di ADN ở hiệu ựiện thế 120 V, cường ựộ 400 mA trong khoảng
thời gian là 30 phút. Do mang ựiện tắch âm, DNA của sản phẩm RT-PCR sẽ dịch chuyển từ cực âm ựến cực dương.
Phát hiện sản phẩm PCR: Kết thúc ựiện di, lấy bản thạch ra khỏi buồng
ựiện di và rửa bản thạch bằng nước, sau đó soi trên máy Dolphin-DOC và chụp ảnh lưu giữ mẫu kiểm trạ Nếu xuất hiện ựoạn DNA quan tâm thì tiến hành tinh sạch sản phẩm RT-PCR.
3.3.3 Khảo sát một số đặc tắnh sinh học của chủng virus cường ựộc viêm gan vịt phân lập ựược vịt phân lập ựược
3.3.3.1 Phương pháp xác định một số đặc tắnh sinh học của chủng virus cường ựộc viêm gan vịt phân lập được trên phơi vịt
3.3.3.1.1 Phương pháp xác ựịnh chỉ số ELD50 của virus cường ựộc viêm gan vịt
* Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm được tiến hành 2 lần/ mẫu, mỗi lần pha giống virus cường ựộc thành 8 nồng ựộ 10-1 ọ 10-8 với nước sinh lý 0,9% có kháng sinh( penicillin + streptomycin). Mỗi nồng độ tiêm 4 phơi liều 0,2ml/phơị Có 4 phơi đối chứng/mẫụ
* Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị trứng: Như phần 3.3.1.1
- Chuẩn bị giống virus cường ựộc: Giống virus cường ựộc ựược dùng ựể pha lỗng trong thắ nghiệm là nước trứng của những phôi chết từ 24-96 giờ trong thắ nghiệm 3.3.1.1 có bệnh tắch điển hình.
* Tiêm trứng: Như phần 3.3.1.1.
Ở các thời ựiểm 18, 24, 48, 72, 96 giờ xác định số phơi chết ở mỗi nồng ựộ. Những phôi chết cho vào tủ lạnh 4oC/8-12 giờ. Mổ trứng, thu nước trứng và kiểm tra bệnh tắch phơị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định tổng số phơi chết sau 96 giờ và tắnh tỷ lệ phơi chết theo công thức: Áp dụng công thức ELD50 của Reed Ờ Muench:
Lg ELD50 = LgA + Xlgf ' ' 50 ' B A A X − − = Trong đó: X: khoảng cách tỷ lệ.
A: là độ pha lỗng virus cận trên 50% AỖ: tỷ lệ % phôi chết ở cận trên 50%. BỖ: tỷ lệ % phôi chết ở cận dưới 50%.
3.3.3.1.2 Phương pháp xác ựịnh chỉ số EID50 của virus cường ựộc viêm gan vịt * Bố trắ thắ nghiệm: Như phần 3.3.2.1.1
* Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị trứng: Như phần 3.3.1.1
- Chuẩn bị giống: giống virus là nước trứng ựược pha loãng với nước sinh lý tạo thành 10 nồng ựộ 10-1 ọ 10-10 như phần 3.3.2.1.1.
- Tiêm trứng: Như phần 3.3.1.1
- Theo dõi phơi đến 96 giờ. Cách 12 giờ kiểm tra phôi 1 lần. Kiểm tra và cho những phôi chết vào tủ lạnh 4oC. Sau 96 giờ cho toàn bộ trứng vào tủ lạnh 4oC/8-12giờ. Mổ trứng, gắp phơi ra đĩa lồng và kiểm tra bệnh tắch của phôị
Tổng số phôi nhiễm Tỷ lệ phôi nhiễm(%) =
Tổng số phôi thắ nghiệm x 100 - Tắnh tốn EID50 theo công thức của Reed - Muench.
3.3.3.2 Phương pháp xác ựịnh một số ựặc tắnh sinh học của chủng virus cường ựộc phân lập ựược khi gây nhiễm trên vịt
3.3.3.2.1. Phương pháp xác ựịnh chỉ số LD50 của chủng virus cường ựộc viêm gan vịt
* Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm được tiến hành 2 lần/ mẫu, mỗi lần tiêm cho 40 vịt/mẫu và có 4 vịt làm ựối chứng/mẫụ
* Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị vịt: Vịt 1 - 7 ngày tuổi, khoẻ mạnh, chưa ựược miễn dịch với virus viêm gan vịt.
- Giống virus cường ựộc viêm gan vịt ựược pha lỗng thành 10 nồng độ 10-1 ọ 10-10 như phần 3.3.3.1.1.
- Tiêm vịt: mỗi nồng độ pha lỗng tiêm 4 con với liều 0,5ml/con vào bắp lườn, vịt đối chứng khơng tiêm. Theo dõi trong 10 ngày ựể quan sát những triệu chứng lâm sàng, xác ựịnh số con chết ở các thời ựiểm theo từng nồng ựộ. Những vịt chết mổ khám kiểm tra bệnh tắch.