2.2.1. Hoá chất
- NaOH 0,1N, HCl 2%, Cồn 99,8% - Tinh bột chỉ thị 0,5%, Axit ascorbic... - Dung dịch fericyanua kali 1%
- KOH 2,5N, AgNO3 0.1N - Metyl xanh 0,5%, K2CrO4 10% - Chỉ thị phenolphtalein
2.2.2. Thiết bị
- Cân phân tích- SHIMADZU & MONOBLOC, Nhật Bản. - Máy đo màu MINOTA-CHROMAMETER CR200/231
- Máy đo độ cứng của quả ABSOLUTE của h/ng Mitutoyo, Nhật Bản. - Máy đo quang UV-1240 SHIMADZU, Nhật Bản.
- Chiết quang kế hiện số- DIGITAL REFACTOMETER- ATAGO, Nhật Bản. - Máy ghép mý- BC08 RIFAV, máy xay.
- Bình tam giác, bình định mức, buret, pipet, cốc đựng. 2.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Ph−ơng pháp vật lý
2.3.1.1. Xác định độ cứng của quả bằng máy đo độ cứng ABSOLUTE Độ cứng của quả đ−ợc biểu thị cho độ già của quả. Độ cứng đ−ợc xác định bằng máy đo độ cứng. Độ cứng của quả đ−ợc xác định bằng độ lún của đầu đo trên thịt quả (mm) d−ới tác dụng của quả cân có trọng l−ợng nhất định (200g) trong một thời gian nhất định (30giây). Nếu trong một thời gian dài di chuyển của đầu đo càng lớn thì độ lún của càng nhỏ.
2.3.1.2. Xác định màu sắc của qủa bằng máy đo màu MINOTA- CHROMAMETER CR200/2
Màu sắc của quả đ−ợc xác định bằng máy đo màu. Nguyên tắc dựa trên sự phản xạ ánh sáng từ bề mặt mẫu tới bộ phận quang phổ của máy. Màu sắc của quả đ−ợc biểu thị qua 3 chỉ số: L, a, b
L: Biểu thị từ sáng tới tối có giá trị từ 0 đến 100
a: Biểu thị từ màu xanh lá cây tới đỏ có giá trị từ - 60 đến + 60 b: Biểu thị từ màu vàng đến xanh da trời có giá trị từ - 60 đến + 60 2.3.1.3. Xác định kích th−ớc của quả bằng th−ớc kẹp
Để đo kích th−ớc của quả (mm), chúng tôi sử dụng th−ớc kẹp hiện số của h/ng Mitutoyo (Nhật Bản).
2.3.1.4. Xác định nồng độ chất hoà tan bằng chiết quang kế
Khi đi từ một môi tr−ờng không khí vào một môi tr−ờng khác (chất lỏng) tia sáng sẽ bị lệch đi (bị khúc xạ), nếu chất lỏng là một dung dịch chất hoà tan (dung dịch đ−ờng, muối...) dựa trên độ lệch của tia sáng ta có thể xác định đ−ợc nồng độ chất hoà tan. Đơn vị đo là 0Bx đo ở 200C.
2.3.2. Ph−ơng pháp hoá học
2.3.2.1. Xác định hàm l−ợng đ−ờng bằng ph−ơng pháp Graxianop
Đ−ờng khử khi đun nóng với dung dịch kiềm cùng với ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đ−ờng khử chuyển thành axit đ−ờng. Dùng
metylen xanh làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc [14], [28].
Ph−ơng trình tổng quát nh− sau:
2K3Fe(CN)6+2KOH+CH2OH(CHOH)4CHO2K4Fe(CN)6+ COOH(CHOH)4COOH + 2H2O
2.3.2.2. Xác định hàm l−ợng muối bằng AgNO3 Dựa trên phản ứng giữa NaCl và AgNO3
NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3
Cho dung dịch chuẩn AgNO3 vào dung dịch trung tính có chứa NaCl, phản ứng sẽ xẩy ra. Khi NaCl trong dung dịch đ/ kết hợp hết với AgNO3 , một giọt AgNO3 thừa sẽ kết hợp với K2CrO4 (dùng làm chỉ thị màu) cho Ag2CrO4 màu đỏ gạch phản ứng đ/ kết thúc [14], [28].
K2CrO4 + AgNO3 Ag2CrO4 + 2 KNO3
2.3.2.3. Xác định hàm l−ợng axit bằng ph−ơng pháp trung hoà
Ph−ơng pháp này dựa trên phản ứng trung hoà giữa các axit hữu cơ và NaOH chuẩn, [14], [28].
2.3.3. Ph−ơng pháp cảm quan
Ph−ơng pháp cảm quan là dựa vào chức năng của các cơ quan thụ cảm nh− vị giác, khứu giác, thị giác, xúc giác, thính giác...để xác định giá trị cảm quan của thực phẩm. Ph−ơng pháp cảm quan đ−ợc dùng để xác định nhanh các chỉ tiêu của nguyên liệu cũng nh− của sản phẩm chế biến, các chỉ tiêu th−ờng đ−ợc xác định bằng ph−ơng pháp cảm quan nh−: Màu sắc, mùi, vị, hình dạng, trạng thái...
Trong đề tài này chúng tôi chọn ph−ơng pháp cảm quan theo thang điểm Hedonic, đây là ph−ơng pháp dùng phép thử mô tả trên thang c−ờng độ có cấu trúc gồm 9 bậc, đánh giá mức độ −a thích nh− sau:
Bảng 2.1: Thang điểm Hedonic
STT Mức đánh giá Điểm đánh giá
1 Hết sức thích 9 điểm
2 Rất thích 8 điểm
3 Thích 7 điểm
4 Hơi thích 6 điểm
5 Chấp nhận đ−ợc 5 điểm
6 Hơi chê 4 điểm
7 Chê vừa 3 điểm
8 Rất chê 2 điểm
9 Không chấp nhận đ−ợc 1 điểm
Mẫu đ−ợc thử ở buồng có ánh sáng có màu thích ứng với màu của mẫu thử. Các thành viên hội đồng cảm quan gồm 9 ng−ời ( một chủ tịch hội đồng, một th− ký và các thành viên), sau khi nếm thử sẽ đánh dấu mức độ −a thích của mình đối với các mẫu trên thang điểm từ 1 đến 9. Kết quả sẽ là điểm trung bình của hội đồng cảm quan [27], [29].
2.3.4. Ph−ơng pháp toán học
Tối −u hoá quá trình nghiên cứu, cụ thể là quá trình muối chua bằng ph−ơng pháp quy hoạch thực nghiệm. Ph−ơng pháp tối −u hoá quá trình là tìm giá trị của các yếu tố Xi để tại đó quá trình tiến hành đạt hiệu quả nhất, nghĩa là các hàm mục tiêu Yi đạt cực trị. Ph−ơng pháp quy hoạch thực nghiệm cho phép nghiên cứu đồng thời tác động của nhiều yếu tố lên quá trình mà chúng ta cần quan tâm, cũng nh− những tác động qua lại của các yếu tố này. Ngoài ra, ph−ơng pháp còn cho phép đánh giá một cách định l−ợng về mức độ ảnh h−ởng của chúng. Ph−ơng pháp này cho phép sử dụng số thí nghiệm chọn lọc ít nhất mà có thể diễn tả đ−ợc nhiều nhất ảnh h−ởng của các yếu tố đ/ chọn. Mục đích chính của nghiên cứu là xác định ảnh h−ởng của một số yếu tố tới quá trình muối chua.
Có rất nhiều yếu tố ảnh h−ởng đến quá trình muối chua cà pháo nh− nhiệt độ, pH, nồng độ chế phẩm vi khuẩn, nồng độ muối, nồng độ cơ chất, thời gian…Qua
các thí nghiệm thăm dò chúng tôi nhận thấy 3 yếu tố là nồng độ chế phẩm vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian ảnh h−ởng nhiều nhất đến quá trình này. Mặt khác để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn 3 yếu tố là: nồng độ chế phẩm vi khuẩn lactic, nồng độ muối và thời gian để tối −u hoá quá trình muối chua cà pháo.
Trong đề tài này, chúng tôi chọn ma trận DOEHLERT để khảo sát vùng tối −u. Ma trận này cho phép tìm đ−ợc vùng tối −u trong khoảng giới hạn đ/ chọn. Ngoài ra ma trận còn cho phép phân chia rất cân đối các điểm thí nghiệm trong giới hạn theo bất kỳ h−ớng nào. Dựa vào ma trận, ta có thể thêm các biến số khác nữa mà không làm mất đi tính đúng đắn của ma trận, [4], [30].
Trong ma trận này, số lần thí nghiệm N và các biến số K đ−ợc xác định nh− sau: N= k2+ k+1.
Trong tr−ờng hợp K= 3 thì số điểm thí nghiệm cần thực hiện là N=13. Cũng theo các biến số đ/ chọn thì ph−ơng trình hồi quy có dạng sau:
Y= b0+ b1X1+ b2X2+ b3X3 + b11X12+ b22X22+ b33X32+ b1X1X2+ b13X1X3 + b23X2X3.
Trong đó : Y- Hàm mục tiêu ( hay các đại l−ợng cần xác định) b- Các hệ số hồi quy. X- Các biến số
Qúa trình tính toán và kết quả đ−ợc xử lý bằng máy tính theo ch−ơng trình NEMROD- New Efficient Methodology For Research Using Optimal Design.
2.3.6. Ph−ơng pháp công nghệ
Các thí nghiệm đ−ợc tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình. 2.3.6.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định độ già của cà pháo
Qủa cà pháo thu hái ở 3 độ già khác nhau
Chỉ tiêu của quan của quả: Màu sắc quả, hình dạng quả… Độ già thích hợp cho muối chua Xác định chất l−ợng nguyên liệu Các thành phần hoá học: Hàm l−ợng chất
khô hoà tan, hàm l−ợng axit… Các chỉ tiêu lý học:
Độ cứng, khối l−ợng quả…
2.3.6.2. Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để muối chua cà pháo
Qủa cà pháo có độ già thích hợp
Các mẫu thí nghiệm
Phân tích các chỉ tiêu chất l−ợng Cắt tai, rửa sạch, để ráo
n−ớc và làm héo Muối, đ−ờng, n−ớc, phụ gia… Nén vỉ, đậy kín, lên men Muối, đ−ờng, n−ớc, phụ gia… Mẫu đối chứng
Nén vỉ, đậy kín, lên men
Phân tích các chỉ tiêu chất l−ợng Sản phẩm Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp Chế phẩm VK lactic: Chủng VK1, VK2, VK3, Lb, Lc
Ch−ơng 3: Kết quả và thảo luận
3.1. Xác định giống và độ già thích hợp của quả cà pháo cho muối chua 3.1.1. Xác định giống cà pháo thích hợp 3.1.1. Xác định giống cà pháo thích hợp
Để xác định giống cà pháo thích hợp cho muối chua chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu cảm quan và phân tích sinh hoá của hai giống cà pháo là cà pháo xanh và cà pháo trắng đ−ợc trồng tại huyện Đông Anh- Hà Nội và huyện Tân Yên- Bắc Giang, đ−ợc thu hái ở các độ già khác nhau. Số liệu phân tích của 2 giống cà đ−ợc thể hiện qua bảng 3.1
Bảng 3.1: Một số chỉ tiêu chất l−ợng của quả cà pháo
STT Chỉ tiêu Cà pháo trắng Cà pháo xanh
1 Số l−ợng (quả)/1kg 80 ữ 90 90 ữ 100
2 Hàm l−ợng chất khô hòa tan (Bx) 5,8 ữ 6,4 6,0 ữ 6,5
3 Hàm l−ợng n−ớc (%) 89 ữ 92 88 ữ 90
4 Hàm l−ợng đ−ờng (%) 1,60 ữ1,70 1,50 ữ1,60
5 Hàm l−ợng axit tổng số (g/l) 0,11 ữ 0,15 0,12 ữ 0,15
6 Hàm l−ợng muối (%) 0,14 ữ 0,15 0,13 ữ 0,14
7 Độ cứng (mm) 1,30 ữ 1,60 1,10 ữ 1,60
8 Màu sắc Màu trắng sữa Màu xanh nhạt
Các thành phần hóa lý của nguyên liệu có liên quan đến quá trình lên men lactic đó là hàm l−ợng đ−ờng, axit...Hàm l−ợng vi sinh vật có trong nguyên liệu là rất lớn và đa số là vi khuẩn. Trong quá trình muối chua cà pháo ng−ời ta th−ờng lợi dụng vi khuẩn lactic có sẵn trong nguyên liệu để lên men.
Trong quá trình muối chua thử nghiệm và dựa vào các kết quả phân tích cảm quan cũng nh− hóa lý chúng tôi nhận thấy cà pháo trắng sau khi muối chua ở các ngày thứ hai, thứ ba th−ờng có độ chua, độ dòn thấp hơn, tỷ lệ thối hỏng, nhăn nhiều, biến màu (thâm đen) nhanh hơn cà pháo xanh. Do vậy chúng tôi chọn giống cà pháo xanh là nguyên liệu cho chế biến cà pháo muối chua tiếp theo
3.1.2. Xác định độ già thích hợp
Chúng tôi tiến hành xác định các chỉ tiêu lý hoá của quả cà pháo ở 3 độ già thu hái khác nhau:
- Mẫu 1: Qủa có độ già thu hái khoảng 60- 70% (t−ơng ứng với 5-7 ngày kể từ ngày đậu quả) ở thời điểm này quả còn non, tai to, vỏ có màu xanh đậm, hạt non, hạt trong.
- Mẫu 2: Qủa có độ già thu hái khoảng 75- 85% (t−ơng ứng với 9- 11 ngày kể từ ngày đậu quả) ở thời điểm này quả to, tai nhỏ so với quả, quả có màu xanh nhạt độ dòn tăng, hạt già.
- Mẫu 3: Qủa có độ già thu hái khoảng 90- 100% (t−ơng ứng với 12- 15 ngày kể từ ngày đậu quả) ở thời điểm này quả to, tai nhỏ so với quả, cà pháo xanh quả có màu xanh hơi vàng đặc biệt là phần dốn quả, độ dòn cao, hạt có màu vàng.
Để xác định độ già thích hợp chúng tôi phân tích và theo dõi các chỉ tiêu gồm hàm l−ợng chất khô hòa tan, đ−ờng tổng số và hàm l−ợng axit ở ba thời điểm thu hái khác nhau. Kết quả thu đ−ợc thể hiện qua bảng sau.
Bảng 3.2: Thành phần hóa học của cà pháo thu hái ở các độ già khác nhau Mẫu
Chỉ tiêu
M1 M2 M3
Hàm l−ợng chất khô hòa tan (0Bx) 5,8 6,3 6,4
Axit tổng số tổng số (g/l) 0,11 0,14 0,13
Đ−ờng tổng số (%) 1,5 1,6 1,6
Độ cứng của quả (mm) 0,55 085 0,90
Qua bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy hàm l−ợng chất khô hòa tan, đ−ờng tổng số tăng, tuy nhiên ở M3 hàm l−ợng đ−ờng lại không tăng. Kết quả thử nghiệm cho thấy: Cà pháo ở mẫu 1 khi muối chua th−ờng nhăn nheo bên ngoài, độ dòn thấp nh−ng dai hay bị nát. Còn cà pháo ở mẫu 2 khi muối chua th−ờng không bị nhăn nheo, có màu vàng trắng, độ dòn cao, ít bị nát. Cà pháo ở mẫu
3 khi muối chua th−ờng có độ cứng cao, độ dòn thấp, có mùi hắc .Tác giả Nguyễn Văn Thoa “ Cà non quá hoặc già quá đều cho hàm l−ợng đ−ờng thấp, cho sản phẩm có chất l−ợng kém” [20]. Do đó chúng tôi chọn cà pháo ở mẫu 2 có độ già thích hợp nhất cho quá trình muối chua.
3.2. Xác định chủng vi khuẩn thích hợp cho quá trình muối chua cà pháo
3.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn
Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là tìm ra chủng vi khuẩn lactic thuần khiết để ứng dụng vào trong quá trình muối chua cà pháo nhằm rút ngắn thời gian lên men, tạo ra đ−ợc sản phẩm có chất l−ợng tốt, ổn định, thời gian bảo quản dài.
Môi trường phân lập MRS (de Man, Rogosa & Sharp, 1960) Bảng 3.3: Thành phần môi tr−ờng MRS Thành phần Hàm lượng (g/l) Thành phần Hàm lượng (g/l) Pepton 10 MgSO4 . 7 H2O 0.2 Cao thịt 10 MnSO4 . 4 H2O 0.04 Cao men 8 Thạch 15 CH3COONa 5 Glucose 20 K2HPO4 2 Nước cất 1000ml Amonicitrat 2
MRS tiệt trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút, pH = 6.5±0.2
Sử dụng môi tr−ờng MRS thạch để phân lập vi khuẩn lactic có trong mẫu n−ớc d−a muối chua tự nhiên sau 48 giờ muối chua.
Từ các khuẩn lạc riêng rẽ, chúng tôi đ/ phân lập đ−ợc một số chủng vi khuẩn sau đó chọn ra ba chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt nhất để tiếp tục nghiên cứu, ký hiệu là chủng VK1, VK2 và VK3.
Cùng với hai chủng vi khuẩn lactic thuần khiết nhập từ Pháp Lb.lactis và
Lc.casei, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm hình thái của năm chủng này. Các đặc điểm trên đ−ợc trình bày ở các bảng 3.4
Bảng 3.4: Một số đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn thí nghiệm
Đặc điểm VK1 VK 2 VK 3 Lb. lactis Lc. casei
Hình dáng khuẩn lạc
Trắng đục, mép không răng c−a,
Tròn, trắng đục, bề mặt nhăn, mép răng c−a, Tròn, trắng sữa ,bề mặt nhẵn bóng Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn bóng Tròn, trắng trong Hình dáng tế bào Hình que, xếp đơn, đôi, chuỗi ngắn Hình cầu, xếp đơn, đôi hoặc chuỗi Hình cầu, xếp đơn, đôi, Hình elíp, xếp đơn, đôi hoặc chuỗi Hình que, xếp đơn, đôi, chuỗi Nhuộm Gram + + + + + Trong MRS lỏng Sinh tr−ởng tốt , đục và có cặn
Bảng 3.5: Khả năng tạo axit lactic của 5 chủng vi khuẩn
STT Chủng vi
khuẩn
Hàm l−ợng axit lactic (g/l)
Hiệu suất lên men, (%) 1 VK1 1,62 82,5 2 VK2 1,89 94,3 3 VK3 1,69 84,5 4 Lb.lactis 1,8 90,1 5 Lc.casei 1,76 88,1
Kết quả phân tích cho thấy cả 5 chủng vi khuẩn đều cho hiệu suất lên men cao. Nh−ng do khả năng lên men đ−ờng saccarose yếu nên chủng VK1 và Lc. casei bị loại và trong các nghiên cứu sau chỉ sử dụng 3 chủng. Tuy nhiên chúng tôi thấy hai chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc VK2 và VK3 có tế bào hình cầu, lên men đồng hình, nhiệt độ phát triển từ 15 - 40oC và đặc biệt không phát triển đ−ợc trong điều kiện pH = 9,5. Do đó chúng tôi có thể kết luận hai chủng này đều
thuộc giống Lactococcus. Chúng tôi đặt tên cho hai chủng này nh− sau: Lactococcus 2 ( Lc. 2), Lactococcus 3 ( Lc.3)
Hình dáng khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng thí nghiệm tiếp đ−ợc trình bày trên các hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6. Hình 3.1: Khuẩn lạc chủng Lc. 2 Hình 3.2: Hình dạng tế bào chủng Lc.2 Hình 3.3: Khuẩn lạc chủng Lc. 3 Hình 3.4: Hình dạng tế bào chủng Lc.3 Hình 3.5: Khuẩn lạc chủng Lactobacillus lactis Hình 3.6 : Hình dạng tế bào chủng Lactobacillus lactis
3.2.3. Xác định khả năng thích ứng của các chủng vi khuẩn
3.2.3.1. Xác định khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
Vì chủng vi khuẩn lựa chọn không những phải có khả năng sinh axit lactic cao trong thời gian ngắn mà còn phải có khả năng lên men trong môi tr−ờng