Bảng 3.2: Kết quả thí nghiệm khử trùng mẫu có khử trùng lần hai với Ca(OCl)2 - nồng độ 0,75% Nghiệm thức Nồng độ Ca(OCl)2 lần một (%) Thời gian xử lý (phút) Tỉ lệ mẫu không bị nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu sống (%) Tn3‟ 3 10 66,67bc±0,00 61,11cd±9,62 Tn4‟ 4 10 61,11c±9,62 50,00d±0,00 Tn7‟ 3 20 83,33ab±0,00 83,33ab±0,00 Tn8‟ 4 20 83,33ab±16,67 50,00d±16,67 Tn10‟ 2 30 83,33ab±16,67 72,22bc±9,62 Tn14’ 2 40 100,00a±0,00 94,44a±9,62 Hình 3.2: Biểu đồ kết quả khử trùng lần 2
Từ Bảng 3.2 cho thấy ta có thể thu nhận được mẫu chuối Laba in vitro khi sử
dụng Ca(OCl)2. Từ Hình 3.1 và 3.2 cho thấy, Ca(OCl)2 2% cho hiệu quả sử dụng khử trùng đến 100% khi thời gian khử trùng là 40 phút. Mặc dù cây chuối có có thân thật (củ chuối) nằm chìm sâu dưới đất, nhưng với cấu trúc được nhiều bẹ lá từ thân giả bao quanh và sắp xếp khít chặt nên ngoại trừ cây bị nhiễm bệnh trước khi tiến hành khử trùng mẫu có thể thấy cây chuối cho tỉ lệ thành công trong khử trùng
44
mẫu khá cao. Ta thấy thời gian khử trùng càng lâu thì hiệu quả khử trùng càng cao, tuy nhiên khi kết hợp với sự gia tăng nồng độ khử trùng thì làm giảm tỷ lệ sống của mẫu. Mẫu bị chết do mô tế bào bị phá huỷ.
Hình 3.3: Kết quả khử trùng mẫu chuối
A: Sau 3 ngày B: Sau 7 ngày
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin,… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần và thí nghiệm phải bỏ đi.
Có ba nguồn nhiễm tạp chính: dụng cụ thuỷ tinh, môi trường, nút đậy không được vô trùng tuyệt đối; trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại sợi nấm, bào tử vi khuẩn; trong quá trình thao tác.
45
Mẫu chuối dùng để khử trùng được lấy từ phần thân thật (củ) vốn nằm trong đất nên thích hợp cho vi khuẩn và nấm phát triển, bên cạnh đó sự nội nhiễm do vi khuẩn cũng rất khó giải quyết. Các loại vi khuẩn thường gặp ở mô thực vật là:
Agrobacterium, Bacillus, Psedomonas,… chúng tạo các bào tử bền nhiệt khi gặp
điều kiện bất lợi nên rất khó tiêu diệt. Khử trùng mẫu chuối gặp khó khăn do mẫu sống mọng nước và nhiều nhựa, dễ bị tổn thương và phần mô sử dụng cho thí nghiệm được bao bọc bởi nhiều lớp bẹ lá cần được tách bỏ. Do đó, tiến hành khử trùng với dung dịch khử trùng bằng cách ngâm là biện pháp giúp giữ được mẫu ít bị tổn thương nhất.
Các chất khử trùng phải ức chế hoặc phá huỷ sự tăng trưởng của vi sinh vật. chúng phải nhạy cảm với vi sinh vật, có khả năng xâm nhập tới nơi bị nhiễm vi sinh vật trên mẫu cấy, nồng độ sử dụng phải thích hợp và có độc tính thấp với tế bào chủ. Cơ chế tác động của chất khử trùng là: phá huỷ lớp màng phospholipid, phân huỷ lipid và acid béo; hình thành chloramine cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật; gây oxy hoá ức chế không thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào,… của tế bào vi sinh vật.
Khi Ca(OCl)2 hoà tan trong nước, chúng sinh ra HOCl, chất này tồn tại trong dung dịch ở hai dạng OCl- và H+. Hai dạng này sẽ chuyển hoá qua lại, tùy theo độ pH của dung dịch.
HOCl tồn tại trong dung dịch, sẽ tác động đến các chất hữu cơ như là một số chất hoà tan, hình thành clorua là một chất oxy hoá mạnh sẽ thay thế nhóm hydro (H) trong nhóm amino (NH) của protein hình thành chloramin dẫn đến sự phá huỷ amino acid, làm biến tính protein. Tính nguyên vẹn của màng nguyên sinh chất bị thay đổi, phospholipid hoặc các acid béo không no của màng tế bào vi sinh vật bị phân huỷ do xà phòng hoá (Estrela và cộng sự, 2002). Ngoài ra để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, ta xử lý cồn 70% trong 30 giây – 1 phút, sau đó mới xử lý trong dung dịch diệt khuẩn.