Mẫu lá thu nhận từ các lần nuôi cấy mô của lần cấy chuyền thứ 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và thứ 10 trong tất cả các lô thí nghiệm và một mẫu lấy từ cây non đầu tiên trồng ngoài vườn ươm.
- Cân 0,12g lá non, nghiền với nitơ lỏng.
- Thêm 800µl CTAB (trước đó cho vào mỗi eppendort 10µl β- mercaptorthenol), đảo ống vài lần để tái huyền phù bột đã nghiền.
- Ủ 650C trong 60 phút, đảo ống mỗi 20 phút.
- Thêm 700µl phenol:cloroform:iso-amylalcohol (PCI) (25:24:1) vào mỗi ống, đảo nhẹ nhàng trong một phút, ly tâm 13000rpm trong 15 phút, chuyển lớp dịch nổi phía trên qua eppendorf 2ml mới.
- Lặp lại bước trên.
- Thêm 500µl Chloroform, trộn đều bằng cách đảo ống nhẹ nhàng, ly tâm ở 10000rpm/5 phút.
- Chuyển nhẹ nhàng phần dịch phía trên qua eppendorf 2ml mới có chứa 800µl isopropanol lạnh (khoảng 5 – 10 phút) DNA sẽ tủa ở dạng tơ trắng.
- Ly tâm 13000 rpm/3 phút, cẩn thận loại hết isopropanol, thu tủa. - Rửa lại bằng cồn 80o ly tâm 13000 rpm/3 phút, loại cồn, hong khô tủa. - Hoà tan lại với 30µl TE ấm.
39
- Xác định sự hiện diện của DNA trong dịch chiết thu được bằng cách điện di trên gel agarose 1% đã nhuộm với ethidium bromide 1mg/ml, trong 40 phút ở 100V, sử dụng đệm TEA 1X. Quan sát kết quả điện di dưới đèn UV.
- Xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong dịch chiết thu được bằng phương pháp đo quang ở các bước sóng 260nm, 280nm. DNA tinh sạch được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.