Hình 3.7. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Fusarium sp., 1+: Bào tử
Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bịức chế và tàn lụi dần, hiệu quảức chế từ 40-60%; 2+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 60-80%; 3+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 80-90%; 4+: Tương tự (1+), hiệu
51 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 _ 1+ 2+ 3+ 4+ Mức độđối kháng S ố l ượ ng c h ủ ng 5 ngày 13 ngày Biểu đồ 3.11. Mức độđối kháng của các chủng Trichoderma với Fusarium sp. Đa số các chủng Trichoderma khảo sát có khả năng đối kháng với Fusarium sp. và mức
độđối kháng có sự khác biệt khá rõ ở 2 mốc thời gian thí nghiệm. Cụ thể, sau 5 ngày khảo sát, 42/47 chủng Trichoderma khảo sát đối kháng mạnh với Fusarium sp. ở các mức độ 3+ và 4+, đến thời điểm 13 ngày thì có 21/47 chủng Trichoderma khảo sát đối kháng với mức độ như trên. Các chủng B3, B5, B6, B9, B10, B11, B26, B33, B35, L2, L3, L6, L7, L8 có khả năng đối kháng khá mạnh với Fusarium sp.
3.5.5. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Colletotrichum sp.
Hình 3.8. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Colletotrichum sp., 1+: Bào tử
Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bịức chế và tàn lụi dần, hiệu quảức chế từ 40-60%; 2+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 60-80%; 3+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 80-90%; 4+: Tương tự (1+), hiệu
52 0 5 10 15 20 25 _ 1+ 2+ 3+ 4+ Mức độđối kháng S ố l ượ ng ch ủ ng 5 Ngày 12 ngày Biểu đồ 3.12. Mức độđối kháng của các chủng Trichoderma với Colletotrichum sp. Mức độđối kháng của Trichoderma đối với Colletotrichum sp. cũng chỉở mức trung bình, với đa số các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng lại Colletotrichum sp.
ở thời điểm 5 ngày, nhưng chỉ có 13/47 chủng có mức độ đối kháng 2+, 3+ và 4+.
Đến thời điểm 12 ngày có 29/36 chủng Trichoderma có mức độđối kháng như trên. Các chủng B7, B23, L1, L11 có khả năng đối kháng khá mạnh với Colletotrichum sp.
3.5.6. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Pythium sp.
Hình 3.9. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Pythium sp., 1+: Bào tử
Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bịức chế và tàn lụi dần, hiệu quảức chế từ 40-60%; 2+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 60-80%; 3+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 80-90%; 4+: Tương tự (1+), hiệu
53 0 2 4 6 8 10 12 14 16 _ 1+ 2+ 3+ 4+ Mức độđối kháng S ố l ượ ng c h ủ ng 5 ngày 13 ngày Biểu đồ 3.13. Mức độđối kháng của các chủng Trichoderma với Pythium sp. Mức độđối kháng của Trichoderma đối với Pythium sp. khá cao, với đa số các chủng
Trichoderma có khả năng đối kháng lại Pythium sp. Ở thời điểm 5 ngày, có 12/47 chủng có mức độ đối kháng 3+ và 4+. Đến thời điểm 12 ngày có 18/36 chủng
Trichoderma có mức độ đối kháng như trên. Các chủng B12, B17, B18, B20, B21, B26, B36, L1, L2, L3, L6, L11có khả năng đối kháng khá mạnh với Pythium sp. Từ các kết quả khảo sát tính đối kháng nêu trên, chúng tôi nhận thấy rằng đa số các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng đối kháng in vitro với một số loài nấm gây bệnh cây trồng, bao gồm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, Fusarium sp., Colletotrichum sp. và Pythium sp. Tuy nhiên,
không có chủng nào có thể đối kháng hoàn toàn được với tất cả các loài nấm bệnh khảo sát (bảng 3.11). Qua đó, chúng tôi cũng đã tuyển chọn được 7 chủng
Trichoderma có ký hiệu chủng B12, B26, L11, B1, B4, B7 và B20 có khả năng đối kháng mạnh với 3-4 loài nấm bệnh khảo sát. Các chủng này có thể sử dụng làm đối tượng nghiên cứu để tạo ra các chế phẩm vi sinh dùng trong bảo vệ thực vật và trong phân bón hữu cơ vi sinh thế hệ mới nhằm chống lại các bệnh do những loài nấm bệnh khảo sát gây ra.
54 Bảng 3.11. Mức độđối kháng đối với tất cả 6 loài nấm bệnh của các chủng Trichoderma đối kháng mạnh nhất Chủng Trichoderma Sclerotium rolfsii Rhizoctonia solani Phytophthora capsici Fusarium sp. Colletotrichum sp. Pythium sp. B1 4+ 4+ 4+ 1+ 2+ 1+ B3 - - 3+ 3+ 2+ 1+ B4 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 1+ B5 1+ 4+ 4+ 4+ 1+ 1+ B6 - 2+ 2+ 3+ 1+ 2+ B7 - 3+ 3+ 2+ 3+ 2+ B8 4+ 4+ 1+ 2+ 1+ - B9 - 2+ 4+ 3+ 1+ - B10 - 1+ 2+ 3+ 1+ 2+ B11 - 2+ 2+ 4+ 1+ 2+ B12 4+ 3+ 4+ 2+ 1+ 4+ B15 - 3+ 2+ - 1+ 2+ B17 - 2+ 3+ 2+ 2+ 3+ B18 - 1+ 3+ 2+ 1+ 3+ B20 1+ 3+ 4+ 1+ 2+ 4+ B21 - - 4+ 1+ 2+ 3+ B23 - 1+ 2+ 2+ 3+ 1+ B24 - 2+ 3+ 2+ 1+ 2+ B25 - 3+ 2+ 2+ 2+ 1+ B26 1+ 3+ 4+ 3+ 2+ 3+ B30 - 3+ 1+ 2+ 2+ 2+ B31 3+ 3+ 2+ 1+ 2+ - B33 - 2+ 2+ 4+ 1+ 1+ B35 - 2+ 1+ 3+ - 1+ B36 - 3+ 2+ - 2+ 3+ L1 - 2+ 2+ 2+ 4+ 3+ L2 - 2+ 2+ 4+ 2+ 3+ L3 1+ 1+ 2+ 3+ 2+ 4+ L5 - 2+ 4+ 1+ 1+ 2+ L6 1+ 2+ 2+ 3+ 1+ 3+ L7 - 2+ 3 4+ 1+ 1+ L8 - 1+ 1+ 3+ 1+ 2+ L11 1+ 3+ 4+ 2+ 3+ 3+
28
Với: x1 và x2 lần lượt là hoạt độ trung bình của enzyme 1 và 2, Δ giả thuyết sự khác nhau giữa trung bình hai dân số (bằng 0 nếu là trắc nghiệm cho hai trung bình bằng nhau), σ1 và σ2 lần lượt là độ lệch chuẩn enzyme 1 và 2, n1 và n2 lần lượt là cỡ mẫu của enzyme 1 và 2.
Zα = Z0,05 = 1,960.
Biện luận kết quả: Nếu Z > Zα: Bác bỏ giả thuyết H0, chấp nhận giả thuyết H1 và ngược lại.
55
4.1. Kết luận
Từ những dữ liệu kết quả thu nhận được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Qua phân lập và sơ bộ định danh, bộ sưu tập 47 chủng Trichoderma đã được hình thành, trong đó 36 chủng từ VQG Bù Gia Mập (ký hiệu chủng B1-B36) và 11 chủng từ VQG Lò Gò Xa Mát (ký hiệu chủng L1-L11), trên 31 mẫu đất thu nhận từ hai VQG này.
2. Đã định danh 13 chủng Trichoderma tới mức độ loài bằng sinh học phân tử dựa trên các vùng bảo tồn ITS1-5.8S-ITS2, với 4 loài hiện diện, bao gồm Trichoderma
asperellum (chủng B1, B5 và L3), T. koningiopsis (chủng B20, B22, B26 và L11), T. virens (chủng B4, B8, B12 và L6), T. harzianum (chủng B11 và L8).
3. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt độ các hệ enzyme thủy phân ngoại bào đã sàng lọc được một số chủng Trichoderma phân lập có hoạt tính cao nhất trong bộ sưu tập.
Đối với chitinase có 4 chủng B7, B8, B15 và B25; đối với β-glucanase có 5 chủng B6, B7, B22, L5 và L10; đối với cellulase có 6 chủng B3, B19, B26, L5, L10 và L11; đối với xylanase có 7 chủng B2, B7, B10, B13, L2, L5 và L7; đối với mannanase có 5 chủng B11, B25, L1, L5 và L7; đối với amylase là 2 chủng L5 và L7; đối với protease là 2 chủng B4 và B8.
4. Khả năng đối kháng mạnh của một số chủng Trichoderma trong bộ giống đối với 6 loài nấm gây bệnh cây trồng được ghi nhận như sau: Đối với Sclerotium rolfsii là 5 chủng B1, B4, B8, B12 và B31; đối với Rhizoctonia solani là 14 chủng B1, B4, B5, B7, B8, B12, B15, B20, B25, B26, B30, B31, B36 và L1; đối với Phytophthora
capsici là 16 chủng B1, B3, B4, B5, B7, B9, B12, B17, B18, B20, B21, B24, B26,
L5, L7 và L11; đối với Fusarium sp. là 14 chủng B3, B5, B6, B9, B10, B11, B26, B33, B35, L2, L3, L6, L7 và L8 ; đối với Colletotrichum sp. là 4 chủng B7, B23, L1 và L11; đối với Pythium sp. là 12 chủng B12, B17, B18, B20, B21, B26, B36, L1, L2, L3, L6 và L11. Như vậy, 7 chủng Trichoderma có ký hiệu chủng B12, B26,
56
4.2. Đề nghị
1. Tiến hành định danh phân tử các chủng Trichoderma còn lại.
2. Nghiên cứu sâu hơn về khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cũng như khả năng đối kháng in vivo (trên đồng ruộng) của các chủng B1, B4, B7, B8, B12, B20, B25, B26, L1, L5, L7, L10 và L11.
58
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, trang 361-362.
2. Lê Đình Đôn và cs (2010), Nghiên cứu tính đa dạng về loài của nấm
Trichoderma tại một số vùng sinh thái khác nhau ở phía nam Việt Nam, Báo cáo nghiệm thu Sở Khoa học và Công nghệ TP. HCM, 94 trang.
3. Đặng Văn Giáp (2003), Bài học vi tính dược: Trắc nghiệm giả thuyết trong nghiên cứu khoa học, Đại Học Y Dược TP. HCM, 67 trang.
4. Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đôn, Nguyễn Tiến Thắng và Ngô Kế Sương (2007a), Khảo sát hoạt tính các enzyme chitinase, β-glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease của các chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam, Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 708-710. 5. Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Tiến Thắng và Ngô Kế Sương
(2007b), Khảo sát khả năng đối kháng in vitro của các chủng nấm
Trichoderma đối với 3 loại nấm gây bệnh cây trồng (Rhizoctonia solani,
Sclerotium rolfsii, Phytophthora palmivora), Báo cáo Hội nghị khoa học Các biện pháp phòng trừ sâu bệnh không gây ô nhiễm môi sinh, NXB Nông nghiệp TP. HCM, trang 84-90.
6. Phạm Văn Lầm (1995), Biện pháp sinh học phòng chống dịch hại nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 236 trang.
7. Dương Minh, Lê Phước Thạnh, Hồ Văn Thiệt, Lê Bảo Ti và Võ Thị Gương (2006), Tác động của các chủng nấm đối kháng Trichoderma nội địa trong việc phòng trị bệnh Phytophthora palmivora gây hại sầu riêng tại Cần Thơ và Bến Tre, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học (Trường ĐH Cần Thơ) 6, trang 154- 161.
59
Tài liệu tiếng Anh
8. Ait-Lahsen, H., Soler, A., Rey, M., De la Cruz, J., Monte, E. and Llobell, A. (2001), An antifungal exo-alpha-1,3-glucanase (AGN13.1) from the biocontrol fungus Trichoderma harzianum, Applied Environmental Microbiology 67, pp. 5833-5839.
9. Andrews, B.A. and Asenjo, J.A. (1987), Continuous culture studies of synthesis and regulation of extracellular β-(1-3)-Glucanase and protease enzymes from Oerskovia xanthineolytica, Biotechnology and Bioengineering 30, pp. 628-637.
10. Arnot, D.E., Roper, C. and Bayoumi, R.A. (1993), Digital codes from hypervariable tandemly repeated DNA sequences in the Plasmodium falciparum circumsporozoite gene can genetically barcode isolates, Molecular and Biochemical Parasitology 61, pp. 15-24.
11. Barak, R., Elad, Y., Mirelman, D. and Chet, I. (1985), Lectins: a possible basis for specific recognition in the interaction of Trichoderma and Sclerotium
rolfsii, Phytopathology 75, pp. 458-462.
12. Benhamou, N. and Chet, I. (1993), Hyphal interactions between Trichoderma
harzianum and Rhizoctonia solani: ultrastructure and gold cytochemistry of
the mycoparasitic process, Phytopathology 83, pp. 1062-1071.
13. Benitez, T., Rincon, A.M., Limon, M.C. and Codon, A.C. (2004), Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains, International Microbiology 7, pp. 249- 260.
14. Bissett, J. (1991a), A revision of the genus Trichoderma II, Infrageneric classification, Canadian Journal of Botany 69, pp. 2357-2372.
15. Bissett, J. (1991b), A revision of the genus Trichoderma III, Section
60
16. Bissett, J. (1991c), A revision of the genus Trichoderma IV, Additional notes on section Longibrachiatum, Canadian Journal of Botany 69, pp. 2418-2420. 17. Buchert, J., Oksanen, T., Pere, J., Siika-Aho, M., Suurnäkki, A. and Viikari, L.
(1998), Application of Trichoderma reesei enzymes in pulp and paper industry, In: Kubicek, C.P. and Harman, G.E. (ed), Trichoderma and Gliocladium: Enzymes, biological control and commercial applications, Taylor and Francis, London, UK, pp. 343-363.
18. Bues, R., Bussieres, P., Dadomo, M., Dumas, Y., Garcia-Pomar, M.I. and Lyannaz, J.P. (2004), Assessing the environmental impacts of pesticides used on processing tomato crops, Agriculture Ecosystems and Environment 102, pp. 155-162.
19. Butcher, J.A. (1968), The ecology of fungi infecting untreated sapwood of
Pinus radiate, Canadian Journal of Botany 46, pp. 1577-1589.
20. Carbone, I. and Kohn L.M. (1993), Ribosomal DNA sequence divergence within internal transcribed spacer 1 of the Sclerotiniaceae, Mycologia 85, pp. 415-427.
21. Carsolio, C., Gutierrez, A., Jimenez, B., Van Montagu, M. and Herrera- Estrella, A. (1994), Characterization of ech42, a Trichoderma harzianum
endochitinase gene expressed during mycoparasitism, Proceedings of the National Academy of Sciences 91, pp. 10903-10907.
22. Chang, Y.C., Chang, Y.C., Baker, R., Kleifeld, O. and Chet, I. (1986), Increased growth of plants in the presence of the biological control agent
Trichoderma harzianum, Plant Disease 70, pp. 145-148.
23. Chen, S.K., Edwards, C.A. and Subler, S. (2001), A microcosm approach for evaluating the effects of the fungicides benomyl and captan on soil ecological processes and plant growth, Applied Soil Ecology 18, pp. 69-82.
61
24. Cherif, M. and Benharnou, N. (1990), Cytochemical aspects of chitin breakdown during the parasitic action of a Trichoderma sp. on Fusarium
oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, Plytopathology 80, pp. 1406-1414.
25. Chet, I., Hadar, Y., Elad, Y., Katan, J. and Henis, Y. (1979), Biological control of soil-borne plant pathogens by Trichoderma harzianum, In:
Schippers, B. and Gams, W. (ed), Soil Born Plant Pathogens, Academic Press, London, UK, pp. 585-592.
26. Chet, I. and Baker, R. (1981), Isolation and biocontrol potential of
Trichoderma hamatum from soil naturally suppressive of Rhizoctonia solani,
Phytopathology 71, pp. 286-290.
27. Chet, I., Harman, G.E. and Baker, R. (1981), Trichoderma hamatum: Its
hyphal interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp., Microbial Ecology 7, pp. 29-38.
28. Chet, I. (1987), Trichoderma - application, mode of action, and potential as biocontrol agent of soilborne plant pathogenic fungi, In: Chet, I. (ed), Innovative Approaches to Plant Disease Control, Wiley-Interscience, New York, USA, pp. 137-160.
29. Chet, I., Benhamou, N. and Haran, S. (1998), Mycoparasitism and lytic enzymes, In: Harman, G.E. and Kubicek, C.P. (ed), Trichoderma and
Gliocladium: Enzymes, biological control and commercial application, Taylor
and Francis, London, UK, pp. 153-172.
30. Clarkson, J.P., Mead, A., Payne, T. and Whipps, J.M. (2004), Effect of environmental factors and Sclerotium cepivorum isolate on sclerotial degradation and biological control of white rot by Trichoderma, Plant Pathology 53, pp. 353-362.
62
31. Cohen-Kupiec, R., Broglie, K.E., Friesem, D., Broglie, R.M. and Chet, I. (1999), Molecular characterization of a novel β-1,3-exoglucanase related to mycoparasitism of Trichoderma harzianum, Gene 226, pp. 147-154.
32. Danielson, R.M. and Davey, C.B. (1973a), The abundance of Trichoderma propagules and the distribution of species in forest soils, Soil Biology and Biochemistry 5, pp. 485-494.
33. Danielson, R.M. and Davey, C.B. (1973b), Non nutritional factors affecting the growth of Trichoderma in culture, Soil Biology and Biochemistry 5, pp. 495-504.
34. Danielson, R.M. and Davey, C.B. (1973c), Carbon and nitrogen nutrition of
Trichoderma, Soil Biology and Biochemistry 5, pp. 505-515.
35. Danielson, R.M. and Davey, C.B. (1973d). Effects of nutrients and acidity on phialospore germination of Trichoderma in vitro, Soil Biology and
Biochemistry 5, pp. 517-524.
36. De la Cruz, J. and Llobell, A. (1999), Purification and properties of a basic endo-β-1,6-glucanase (Bgn16.1) from the antagonistic fungus Trichoderma
harzianum, European Journal of Biochemistry 265, pp. 145-151.
37. De la Cruz, J., Pintor-Toro, J.A., Benitez, T., Llobell, A. and Romero, L.C. (1995), A novel endo-beta-1,3-glucanase, BGN13.1, involved in the
mycoparasitism of Trichoderma harzianum, Journal of bacteriology 177, pp. 6937-6945.
38. De la Cruz, J., Rey, M., Lora, J.M., Hidalgo-Gallego, A., Dorninguez, F., Pintor-Toro, J.A., Llobell, A. and Benitez, T. (1993), Carbon source control on
β-glucanases, chitobiase and chitinase from Trichoderma harzianum, Archives of Microbiology 159, pp. 316-322.
64
48. Elad, Y., Barak, R., Chet, I. and Henis, Y. (1983a), Ultrastructural studies of interaction between Trichoderma spp. and plant pathogenic fungi, Journal of Phytopathology 107, pp. 168-175.
49. Elad, Y., Chet, I., Boyle, P. and Henis, Y. (1983b), Parasitism of Trichoderma spp. on Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii-scanning electron microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73, pp. 85-88.
50. Elad, Y., Chet, I. and Baker, R. (1987), Increased growth response of plants