nấm gây bệnh cây trồng [5, 78, 120]
Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm, vô trùng, khoan lấy một phần thạch ở rìa khuẩn lạc nấm bệnh và đặt vào đĩa Petri 90 mm, có chứa môi trường PDA. Sao cho điểm đặt cách mép Petri 2cm. Tiếp theo, lấy khuẩn lạc Trichoderma spp. theo cách tương tự và đặt vào đĩa Petri đã chứa nấm bệnh ở trên. Điểm đặt khoanh thạch
Trichoderma cũng cách mép Petri 2 cm nhưng ở phía đối diện với nấm bệnh. Đểđối chứng, khoanh thạch nấm bệnh cùng kích cỡ, được đặt giống như trên, trong các Petri cùng loại chứa môi trường PDA đã khử trùng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và đem ủở nhiệt độ 28 – 30oC.
Có hai chỉ tiêu theo dõi được thực hiện trong thử nghiệm này:
- Phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợ nấm (Percent Inhibition of Mycelia Growth, PIMG): Sau 5 ngày nuôi cấy đối kháng trực tiếp, đánh giá mức độ đối kháng bằng cách đo bán kính của khuẩn lạc nấm bệnh theo phương khuẩn lạc nấm bệnh (R2) và bán kính của khuẩn lạc nấm bệnh trong đĩa đối chứng (R1) như hình 2.1. Các số liệu được tính toán theo công thức: PIMG = (R1 – R2)/ R1 × 100, hoặc được quy ước các mức như sau:
1+: Bào tử Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bịức chế và tàn lụi dần, hiệu quảức chế từ 40-60%;
27
2+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 60-80%;
3+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 80-90%;
4+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế > 90%; -: ngoài các trường hợp trên.
- Số ngày đối kháng lại hoàn toàn nấm bệnh của Trichoderma: Sau khi đo và tính phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm sau 5 ngày, việc theo dõi vẫn tiếp tục để ghi nhận thời gian Trichoderma đối kháng lại hoàn toàn nấm bệnh thực vật. Thời gian mọc che kín khuẩn lạc nấm bệnh được ghi nhận cho từng chủng Trichoderma
kể cả những chủng mọc che kín sớm nhất và muộn nhất. Tuy nhiên, thời gian tối đa cho thí nghiệm là 14 ngày.
Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp R1/R2: sự phát triển hệ sợi nấm bệnh và T: Trichoderma spp. 2.2.7. Xử lý, tổng hợp số liệu [3]
Các dữ liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm MS - Excel 2003 [3].
Trắc nghiệm z với phương sai biết trước (z-Test: Two Sample for Means) (dùng trong phân tích mối tương quan về hoạt độ trung bình giữa các hệ enzyme phân giải polysaccharid)
Đặt giả thuyết: H0: µ1 = µ2 (hoạt độ trung bình của hai enzyme là như nhau, hay hai enzyme có mối tương quan với nhau), H1: µ1 ≠ µ2 (hoạt độ trung bình của hai enzyme khác nhau, hay hai enzyme không có mối tương quan với nhau). Phân tích thống kê:
29
3.1. Thu nhận các mẫu đất từ hai VQG Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát
VQG Bù Gia Mập có diện tích rừng tự nhiên lớn, chiếm hơn 21.000 ha, sinh cảnh rừng mưa nhiệt đới thường xanh với các thảm thực vật khác nhau bao phủ, như lồ ô, lô ô xen gỗ, gỗ xen lồ ô, cây gỗ,… thích hợp cho sự khu trú và sinh trưởng của các hệ vi sinh vật đất, trong đó có Trichoderma. 22 mẫu đất đã được thu nhận từ VQG Bù Gia Mập tại những nơi có các đặc điểm thổ nhưỡng đặc trưng, cụ thể: 01 mẫu
đất ở vị trí cây gỗ đang phân hủy (Bù Gia Mập 1) – Đây là một trong những vị trí thường thấy có sự hiện diện của Trichoderma trong tự nhiên; 01 mẫu đất ở ven bờ
suối, chạy dọc bên trong vườn quốc gia, hai bên là rừng lồ ô xen gỗ (Bù Gia Mập 4); 04 mẫu đất ở rừng cây lồ ô (Bù Gia Mập 10, 11, 12, 14); 02 mẫu đất ở vùng rừng cây gỗ xen lồ ô (Bù Gia Mập 13, 16) và 14 mẫu đất ở rừng cây gỗ (Bù Gia Mập 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22).
Tổng số mẫu đất được thu nhận từ VQG Lò Gò Xa Mát là 9 mẫu, ký hiệu Lò Gò Xa Mát 1 – 9. So với VQG Bù Gia Mập, VQG Lò Gò Xa Mát có những đặc điểm thổ
nhưỡng riêng, với địa hình bằng phẳng và cao độ trung bình 13 m nên chủ yếu là những rừng ngập nước và trảng cỏ, thuộc sinh cảnh đất xám trên nền phù sa cổ. Hình ảnh cụ thể các địa điểm thu nhận mẫu đất tại hai VQG Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát được thể hiện ở hình 3.1.
Như vậy, tổng cộng 31 mẫu đất đã được thu thập từ hai VQG Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát. Các mẫu đất này được sử dụng để phân lập các chủng Trichoderma trong nghiên cứu. Bên cạnh đó, một số chỉ tiêu lý hóa đất, bao gồm độ mặn, độẩm và pH, của các mẫu đất này cũng đã được phân tích. Tổ hợp các số liệu ghi nhận được dùng
để xác định sự hiện diện của các chủng Trichoderma trong các mẫu đất, đồng thời xác định mối tương quan giữa sự hiện diện của Trichoderma với các chỉ tiêu lý hóa
30
Bù Gia Mập1 Bù Gia Mập 2 Bù Gia Mập 3 Bù Gia Mập 4
Bù Gia Mập 5 Bù Gia Mập 6 Bù Gia Mập 7 Bù Gia Mập 8
Bù Gia Mập 9 Bù Gia Mập 10 Bù Gia Mập 11 Bù Gia Mập 12
Bù Gia Mập 13 Bù Gia Mập 14 Bù Gia Mập 15 Bù Gia Mập 16
Bù Gia Mập 17 Bù Gia Mập 18 Bù Gia Mập 19 Bù Gia Mập 20
31
Lò Gò Xa Mát 3 Lò Gò Xa Mát 4 Lò Gò Xa Mát 5 Lò Gò Xa Mát 6
Lò Gò Xa Mát 7 Lò Gò Xa Mát 8 Lò Gò Xa Mát 9
Hình 3.1. Các địa điểm thu nhận mẫu đất tại hai VQG Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát
3.2. Phân lập các chủng Trichoderma
Chúng tôi tiến hành phân lập các chủng Trichoderma trên môi trường chọn lọc chuyên biệt TSM cải tiến. Dựa vào tính chọn lọc chuyên biệt cho giống nấm
Trichoderma của môi trường TSM cải tiến và hình thái khuẩn lạc đặc trưng của các khuẩn lạc phát triển trên môi trường này, những khuẩn lạc có triển vọng là
Trichoderma được chọn lọc, làm thuần và bảo quản trên môi trường PDA ở 4oC. Kết quả, chúng tôi đã phân lập được tổng cộng 47 chủng triển vọng là Trichoderma, trong đó 36 chủng (ký hiệu chủng từ B1-B36) được phân lập từ 22 mẫu đất thuộc VQG Gia Bù Gia Mập và 11 chủng (ký hiệu chủng L1-L11) được phân lập từ 9 mẫu
đất thuộc VQG Lò Gò Xa Mát. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc trưng sơ lược của 47 chủng Trichoderma phân lập trên môi trường PDA được thể hiện trong bảng 3.1. Hình ảnh đặc trưng trên môi trường PDA của 47 chủng triển vọng thuộc giống nấm
32
Bảng 3.1. Sơ lược đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc trưng của 47 chủng Trichoderma phân lập trên môi trường PDA
Chủng
Trichoderma Đặc điểm hình thái Nơi phân lập
B1
Sợi tơ dạng bông mịn, dày, đan xen vào nhau, màu trắng sữa. Rìa là các sợi tơ mảnh trong suốt. Sau 3 ngày chưa thấy xuất hiện bào tử.
Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 57 mm. Bào tử
hiện rõ sau 5 ngày nuôi cấy, là những nốt sần khá lớn màu lục, tạo một vòng tròn trên đĩa thạch, đúng với đặc điểm đặc trưng thường thấy ở
giống nấm này. Không thấy hiện tượng tiết sắc tố ra ngoài môi trường.
Bù Gia Mập 1
B2
Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy vào khoảng 61 mm. Có sự
hình thành bào tử vào ngày thứ 3 sau nuôi cấy, bắt đầu với những nốt sần trắng lục nhạt, sau đó đậm dần lên. Bào tử chiếm thành mảng trong ở giữa đĩa Petri nuôi cấy. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường.
Bù Gia Mập 1
B3
Cách mọc khuẩn lạc cũng khá giống với B2. Tuy nhiên, sau 3 ngày nuôi cấy đường kính khuẩn lạc đạt khoảng 71 mm, chưa thấy sự hình thành bào tử. Bào tử xuất hiện vào khoảng ngày thứ 6, ở mép đĩa hiện rõ nhất, màu lục đậm. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường.
Bù Gia Mập 1
B4
Khuẩn lạc gồm các sợi tơ dạng bông mảnh, đan xen vào nhau, màu trắng đục tương tự như B1. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy vào khoảng 62 mm. Chưa thấy sự hình thành bào tử sau 3 ngày nuôi cấy. Bào tử xuất hiện ở khoảng ngày thứ 6, màu lục, dày ở viền đĩa. Không thấy hiện tượng tiết sắc tố ra ngoài môi trường.
Bù Gia Mập 1
B5
Khuẩn lạc gồm các sợi tơ mảnh, mọc nổi lên trên mặt thạch. Các sợi tơ
mọc theo dạng tia, hướng ra ngoài. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 53 mm. Bào tử xuất hiện khoảng sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. Đến ngày thứ 5, bào tửđã phát triển đầy đủ, có màu lục đan xen trong lớp tơ dày. Có mùi hương dừa. Không tiết sắc tố ra môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 1
B6
Khuẩn lạc có dạng bông mịn, màu trắng sữa. Các sợi tơ đan xen vào nhau không thấy rõ từng sợi. Rìa bao quanh bởi các sợi tơ trong suốt.
Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy vào khoảng 72 m. Bào tử
xuất hiện vào khoảng ngày thứ 4, tạo vòng nốt sần xung quanh mép
đĩa, màu lục. Bên trong cũng tạo 2 vòng bào tử đan xen trong lớp tơ
mỏng. Không sắc tố tiết ra ngoài môi trường.
Bù Gia Mập 1
B7
Khuẩn lạc gồm những sợi tơ mảnh mọc sát mặt thạch, theo dạng tia hướng ra ngoài. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày đạt khoảng 78 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 4. Bào tử màu lục nhạt sau đó
đậm dần lên, tạo vòng tròn hiện rõ trên mặt thạch. Không tiết sắc tố ra môi trường.
Bù Gia Mập 2
B8
Các sợi tơ mảnh, dạng tia hướng ra ngoài, tạo bộng ở giữa. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày khoảng 73 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 5, tạo vòng tròn trên đĩa thạch. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường nuôi cấy.
33
B9
Khuẩn lạc có dạng bông mịn, các sợi tơđan xen vào nhau, màu trắng sữa. Mặt cắt ngang khuẩn lạc dạng hình chuông vun cao ở đỉnh.
Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày đạt khoảng 70 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 4, màu lục đậm. Không tiết sắc tố ra môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 3
B10
Hình dạng và các mọc khuẩn lạc tương tự với B7. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày đạt khoảng 65 mm. Sau 5 ngày nuôi cấy, bào tửđã hiện rõ. Bào tử là những nốt sần màu lục nhạt, tạo thành vòng tròn trên đĩa Petri. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 3
B11
Tơ nấm phát triển mạnh, gồm những sợi mảnh, mọc lan trên mặt thạch, tạo bộng ở giữa. Sau 3 ngày nuôi cấy, tơ nấm đã phát triển hết
đĩa và bắt đầu tạo bào tử. Sau 5 ngày, bào tử đã dày đặc trong đĩa Petri. Bào tử là những nốt sần màu lục đặc trưng, tạo vòng tròn trong
đĩa thạch. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 3
B12
Khuẩn lạc gồm những sợi tơ mảnh, mọc đan xen vào nhau, màu trắng sữa nhạt. Rìa có những sợi tơ trong suốt, mọc sát mặt thạch. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày đạt khoảng 66 mm. Bào tử xuất hiện vào ngày thứ 4, tạo vòng tròn mảnh trên đĩa thạch. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 3
B13
Khuẩn lạc gồm những sợi tơ trắng bông, mọc nổi cao trên mặt thạch.
Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày đạt khoảng 64 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào khoảng ngày thứ 5, tạo vòng tròn màu lục đặc trưng. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 5
B14
Khuẩn lạc gồm những sợi tơ dày, mọc hướng tia ra ngoài mép đĩa, tạo bộng nhỏở giữa. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày đạt khoảng 68 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào khoảng ngày thứ 4, tao 1 vòng tròn với những nốt sần dày đặc khắp bề mặt khuẩn lạc. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường.
Bù Gia Mập 6
B15 Hình thái khuẩn lạc tương tự như B3, tuy nhiên bào tử màu lục nhạt. Bù Gia Mập 6
B16 Hình thái khuvà màu lục nhẩạn lt hạơc tn. ương tự với B7, tuy nhiên vòng bào tử mảnh hơn Bù Gia Mập 6
B17
Khuẩn lạc phát triển khá chậm, với những sợi tơ trong suốt, mọc hướng tia ra ngoài mép đĩa, tạo bộng ở giữa. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày đạt khoảng 48 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vòng quanh mép đĩa vào khoảng ngày thứ 6. Tuy nhiên, bào tử chìm lấp trong lớp tơ nấm nên không thấy rõ. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường.
Bù Gia Mập 7
B18 quanh mép Hình thái khuđĩa. ẩn lạc tương tự B8, tuy nhiên vòng bào tử mọc bao Bù Gia Mập 8
B19
Khuẩn lạc mọc hướng tia ra ngoài. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 65 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 4, tạo vòng tròn nốt sần trên đĩa nuôi cấy. Không tiết sắc tố ra môi trường.
Bù Gia Mập 8
B20
Sợi tơ mảnh, mọc sát mặt thạch, tạo bộng ở giữa. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 54 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào ngày thứu 6, tạo vòng tròn không rõ, màu lục vàng nhạt. Không tiết sắc tố ra môi trường nuôi cấy.
34
B21 nHình thái khuốt sần lớn hơn và có màu lẩn khạc khá giục nhống vạt hới B12, tuy nhiên bào tơn. ử là những Bù Gia Mập 9
B22 tCách mử màu lọục khuc trên khẩn lắạp bc khá giề mặt ốđĩng va nuôi cới B18, tuy nhiên chấy. ủng này tạo bào Bù Gia Mập 9
B23
Khuẩn lạc tạo bộng ở giữa, sợi tơ phát triển dạng tia hướng ra ngoài.
Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 68 mm. Bào tử
bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 4, là những nốt sần lớn, màu lục nhạt, sau đó chuyển sang màu lục xỉn. Không tiết sắc tố ra môi trường.
Bù Gia Mập 9
B24 Hình thái khusần bào tử rõ hẩơn ln. ạc tương tự như B20, tuy nhiên hệ sợi dày hơn và nốt Bù Gia Mập 9
B25 mHình thái khuỏng hơn. ẩn lạc tương tự như B26, tuy nhiên vòng nốt sần bào tử Bù Gia Mập 9
B26 hHình thái khuơn, màu lục bao quanh mép ẩn lạc khá giốđĩng va. ới B17, tuy nhiên vòng bào tử dày Bù Gia Mập 10
B27
Sợi tơ rất mảnh, mọc sát mặt thạch, không màu. Đường kính khuẩn lạc sau 3 ngay nuôi cấy đạt khoảng 49 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện từ
ngày thứ 6, với vòng trắng hiện rõ, tiếp đến là những cụm bào tử lớn, tạo các vòng tròn đồng tâm. Không tiết sắc tố ra môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 11
B28 Hình thái khunhạt hơn và lượẩn lng bào tạc tươửng t nhiềựu h vớơi B27, tuy nhiên bào tn. ử có màu lục Bù Gia Mập 11
B29
Các sợi tơ mảnh, mọc dạng tia hướng ra ngoài, tạo bộng ở giữa.
Đường kính sau 3 ngày nuôi cấy vào khoảng 73 mm. Bào tử bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 5, là những nốt sần lớn, màu lục nhạt, bao quanh mép đĩa. Không tiết sắc tố ra ngoài môi trường nuôi cấy.
Bù Gia Mập 15
B30 quanh mép Hình thái khuđĩa, dày tẩn lạc từươ trong ra ngoài. ng tự với B11, tuy nhiên bào tử mọc đều vòng Bù Gia Mập 15
B31 hHình thái khuơn, dày hơn và có màu lẩn lạc tương tục nhự vạt hới B26, tuy nhiên lơn. ượng bào tử nhiều Bù Gia Mập 20