vào khả năng sinh tổng hợp một số enzyme thủy phân trên môi trường cơ chất đặc hiệu
Việc lựa chọn thời điểm để khảo sát hoạt độ enzyme dựa trên đường kính vòng phân giải cơ chất phải hội đủ các tiêu chí: có sự phân giải cơ chất, có sự chênh lệch khác biệt rõ ràng về hoạt độ enzyme của chủng khảo sát. Ngoài ra, phải chọn được thời điểm mà đường kính vòng phân giải không vượt quá 90 mm, đường kính tối đa của đĩa Petri.
Dựa vào các số liệu thực nghiệm thu nhận được (xem phần phụ lục), chúng tôi nhận thấy: sau 36 giờ nuôi cấy, ở hầu hết các chủng Trichoderma khảo sát, lượng enzyme
được tổng hợp chưa nhiều, thậm chí một số chủng chưa ghi nhận sự phân giải cơ
chất; đồng thời cũng chưa ghi nhận sự khác biệt rõ ràng về hoạt độ enzyme giữa các chủng Trichoderma. Đến thời điểm 48 giờ nuôi cấy, lượng enzyme sinh tổng hợp của các chủng Trichoderma nhiều hơn, có sự khác biệt khá rõ ràng về hoạt độ
enzyme giữa các chủng với các mức độ thấp, trung bình và cao. Bên cạnh đó, đã xuất hiện một số chủng Trichoderma có đường kính vòng phân giải gần đạt mức 90 mm, đường kính tối đa của đĩa Petri. Như vậy, kết quả hoạt độ enzyme của các mốc thời gian tiếp theo (60 giờ, 72 giờ) có thể sẽ không chính xác, bởi vì hoạt độ
enzyme của một số chủng Trichoderma khảo sát đã đạt mức tối đa ở thời điểm trước đó. Cho nên, thời điểm 48 giờ nuôi cấy trên thạch đĩa TSM có thể xem là mốc thời gian chung hợp lý nhằm so sánh hoạt độ enzyme giữa các chủng Trichoderma. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ trình bày kết quả khảo sát hoạt độ một số hệ
enzyme thủy phân của 47 chủng Trichoderma spp. sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả chi tiết của tất cả bốn mốc thời gian 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ khảo sát bảy hệ
39 3.4.1. Hoạt độ chitinase 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Chủng Trichoderma Đươ ̀ ng ki ́ nh v o ̀ ng p h ân gi a ̉ i ( m m )
Biểu đồ 3.1. Hoạt độ chitinase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% chitin huyền phù. Số thứ tự từ 1-36 tương ứng với các chủng Trichoderma có ký hiệu từ B1-B36, số thứ tự từ 37-47 tương ứng với các
chủng Trichoderma có ký hiệu từ L1-L11
Kết quả khảo sát cho thấy, tất cả 47 chủng Trichoderma đều có khả năng sinh tổng hợp hệ chitinase (biểu đồ 3.1). Tuy nhiên, hoạt độ chitinase cao thấp khác nhau tùy thuộc chủng khảo sát, với 4 chủng có hoạt độ chitinase cao (D ≥ 50 mm), 25 chủng có hoạt độ chitinase trung bình (30 ≤ D < 50 mm), 18 chủng cho hoạt độ chitinase thấp (D < 30 mm). Các chủng B7, B8, B15, B25 có khả năng phân giải chitin huyền phù tốt nhất. Hoạt độ chitinase của các chủng này cũng tương đương với hoạt độ các chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao trong nghiên cứu của Lê
Đình Đôn và cs (2010) [2].
Bảng 3.3.Đường kính vòng phân giải của 4 chủng Trichoderma cao nhất trên nguồn cơ chất chitin huyền phù
Chủng B7 B8 B15 B25
D (mm)* 55,0 ± 0 57,0 ± 0 51,5 ± 0,7 52,0 ± 0 (*p<0,05)
40 3.4.2. Hoạt độβ-glucanase 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Chủng Trichoderma Đươ ̀ ng k i ́ nh v o ̀ ng ph ân gi a ̉ i ( mm)
Biểu đồ 3.2. Hoạt độβ-glucanase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% β-glucan. Số thứ tự từ 1-36 tương ứng với các
chủng Trichoderma có ký hiệu từ B1-B36, số thứ tự từ 37-47 tương ứng với các chủng Trichoderma có ký hiệu từ L1-L11
Tương tự như chitinase, 47 chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp hệ β-glucanase và hoạt độ enzyme này cũng thay đổi phụ thuộc vào chủng
Trichoderma khảo sát. Trong đó, hoạt độ của 5 chủng cho hoạt độ β-glucanase cao (D ≥ 50 mm), 12 chủng cho hoạt độ β-glucanase trung bình (30 ≤ D < 50 mm), 30 chủng cho hoạt độβ-glucanase thấp (D < 30 mm). Các chủng B6, B7, B22, L5, L10 có khả năng phân giải β-glucan tốt nhất. Hoạt độ β-glucanase của các chủng này cũng tương đương với hoạt độ các chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp β- glucanase cao trong nghiên cứu của Lê Đình Đôn và cs (2010) [2].
Bảng 3.4.Đường kính vòng phân giải của 5 chủng Trichoderma cao nhất trên nguồn cơ chất β-glucan
Chủng B6 B7 B22 L5 L10
D (mm)* 67,0 ± 0 60,5 ± 0,7 50,5 ± 0,7 53,5 ± 0,7 56,5 ± 0,7 (*p<0,05)
41 3.4.3. Hoạt độ cellulase 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Chủng Trichoderma Đư ờ ng k i ́ nh v o ̀ ng phâ n gi a ̉ i ( m m )
Biểu đồ 3.3. Hoạt độ cellulase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% carboxymethyl cellulose. Số thứ tự từ 1-36 tương
ứng với các chủng Trichoderma có ký hiệu từ B1-B36, số thứ tự từ 37-47 tương
ứng với các chủng Trichoderma có ký hiệu từ L1-L11
Tất cả các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase. Trong đó, 26 chủng cho hoạt độ cellulase trung bình (30 ≤ D < 50 mm), 21 chủng cho hoạt độ cellulase thấp (D < 30 mm). Các chủng B3, B19, B26, L5, L10, L11 có khả năng phân giải cellulose tốt nhất.
Theo Klein và Eveleigh (1998) [86] mặc dù phần lớn các loài Trichoderma ssp.
được ghi nhận là có khả năng phân giải cellulose rõ rệt, nhưng ở những vùng đất rừng với sự phong phú của các loại cơ chất, khả năng phân huỷ các loại gỗ tự nhiên (lignocellulose) của chúng tương đối yếu. Trong các nghiên cứu nuôi cấy thuần túy, một số loài Trichoderma spp. đã phân hủy không hiệu quả các lá cây thù du (dogwood), cây thông [32] và gỗ cây sồi (beechwood) [19].
Bảng 3.5.Đường kính vòng phân giải của 6 chủng Trichoderma cao nhất trên nguồn cơ chất carboxymethyl cellulose
Chủng B3 B19 B26 L5 L10 L11
D (mm)* 45,0 ± 0 46,5 ± 0,7 41,0 ± 1,4 42,5 ± 2,1 40,5 ± 0,7 46,0 ± 0 (*p<0,05)
42 3.4.4. Hoạt độ xylanase 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Chủng Trichoderma Đ ư ờ n g k i ́ n h vo ̀ n g p h ân g ia ̉ i ( m m )
Biểu đồ 3.4. Hoạt độ xylanase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% xylan. Số thứ tự từ 1-36 tương ứng với các chủng
Trichoderma có ký hiệu từ B1-B36, số thứ tự từ 37-47 tương ứng với các chủng
Trichoderma có ký hiệu từ L1-L11
Tất cả 47 chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp hệ xylanase. Trong đó, 2 chủng cho hoạt độ xylanase cao (D ≥ 50 mm), 23 chủng cho hoạt độ
xylanase trung bình (30 ≤ D < 50 mm) và số còn lại (22 chủng) cho hoạt độ
xylanase thấp (D < 30 mm). Các chủng B2, B7, B10, B13, L2, L5, L7 có khả năng phân giải xylan tốt nhất.
Bảng 3.6.Đường kính vòng phân giải của 7 chủng Trichoderma cao nhất trên nguồn cơ chất xylan
Chủng B2 B7 B10 B13 L2 L5 L7
D (mm)* 48,0 ± 0 45,0 ± 0 59,0 ± 0 49,0 ± 0 46,0 ± 1,4 48,0 ± 1,4 50,0 ± 1,4 (*p<0,05)
43 3.4.5. Hoạt độ mannanase 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Chủng Trichoderma Đư ờ ng ki ́ nh v o ̀ n g ph ân gi a ̉ i ( m m )
Biểu đồ 3.5. Hoạt độ mannanase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% guargum. Số thứ tự từ 1-36 tương ứng với các
chủng Trichoderma có ký hiệu từ B1-B36, số thứ tự từ 37-47 tương ứng với các chủng Trichoderma có ký hiệu từ L1-L11
Tất cả các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp hệ
mannanase khá cao, với hầu hết các chủng có hoạt độ ở mức trung bình trở lên. Cụ
thể, 10 chủng cho hoạt độ mannanase cao (D ≥ 50 mm), 24 chủng cho hoạt độ
mannanase trung bình (30 ≤ D < 50 mm), 13 chủng cho hoạt độ mannanase thấp (D < 30 mm). Các chủng B11, B25, L1, L5, L7 có khả năng phân giải guargum tốt nhất.
Bảng 3.7.Đường kính vòng phân giải của 5 chủng Trichoderma cao nhất trên nguồn cơ chất guargum
Chủng B11 B25 L1 L5 L7
D (mm)* 65,0 ± 0 67,0 ± 0 71,0 ± 1,4 76,0 ± 1,4 78,0 ± 1,4 (*p<0,05)
44 3.4.6. Hoạt độ amylase 0 5 10 15 20 25 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Chủng Trichoderma Đư ờ ng k i ́ nh vo ̀ ng ph ân gi a ̉ i ( mm)
Biểu đồ 3.6. Hoạt độ amylase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% tinh bột. Số thứ tự từ 1-36 tương ứng với các chủng Trichoderma có ký hiệu từ B1-B36, số thứ tự từ 37-47 tương ứng với các
chủng Trichoderma có ký hiệu từ L1-L11
Hầu hết các chủng Trichoderma khảo sát đều không có khả năng sinh tổng hợp hệ
amylase. Chỉ có 2 chủng L5 và L7 phân giải được tinh bột, tuy nhiên hoạt độ của chúng cũng chỉ ở mức thấp (D < 30 mm). Điều này chứng tỏ khả năng phân giải tinh bột không phải là thế mạnh của giống nấm Trichoderma.
Bảng 3.8.Đường kính vòng phân giải của 2 chủng Trichoderma L5 và L7 trên nguồn cơ chất tinh bột Chủng L5 L7 D (mm)* 19,5 ± 0,7 17,5 ± 0,7 (*p<0,05) 3.4.7. Hoạt độ protease 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Chủng Trichoderma Đ ư ờ ng k ính v ò n g ph ân gi ả i ( m m )
Biểu đồ 3.7. Hoạt độ protease của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% gelatin. Số thứ tự từ 1-36 tương ứng với các chủng
45
Trichoderma có ký hiệu từ B1-B36, số thứ tự từ 37-47 tương ứng với các chủng
Trichoderma có ký hiệu từ L1-L11
Tất cả các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease (biểu đồ 3.7). Tuy nhiên, hoạt độ protease của các chủng Trichoderma
không có sự chênh lệch khác biệt, đường kính vòng phân giải dao động từ 30-40 mm. Từ đây, có thểđưa ra giả thuyết rằng khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng Trichoderma là tương đối đồng đều. Điều này cũng phù hợp với nhận định của Đinh Minh Hiệp và cs (2007a) [4].
Bảng 3.9.Đường kính vòng phân giải của 2 chủng Trichoderma cao nhất trên nguồn cơ chất gelatin
Chủng B4 B8
D (mm)* 47,5 ± 0,7 46,0 ± 0
(*p<0,05)
3.4.8. Chọn lựa các chủng Trichoderma có tiềm năng sinh tổng hợp các hệ
enzyme thủy phân hoạt độ cao
Từ các dữ liệu đã nêu trên, chúng tôi nhận thấy đa số các chủng nấm Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp các hệ chitinase, β-glucanase, cellulase, xylanase, mannanase, protease. Kết quả này phù hợp với nhận định của Đinh Minh Hiệp và cs (2007a) [4]. Tương tự, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, ngoại trừ lignin, các polysaccharide như cellulose, chitin, tinh bột, xylan và pectin đều bị phân hủy dễ dàng bởi hầu hết các loài Trichoderma thông qua việc tiết những enzyme polysaccharase đặc biệt [40, 86].
Thông qua việc đánh giá hoạt độ của các chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp chitinase, β-glucanase, cellulase, xylanase, mannanase, amylase và protease cao nhất, chúng tôi đã chọn được 6 chủng Trichoderma cho tổ hợp hoạt độ các enzyme nêu trên cao nhất (bảng 3.10). Những chủng này có thểđược sử dụng làm đối tượng nghiên cứu nhằm thu nhận các chế phẩm enzyme có hoạt tính cao, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
46
Đây gần như là nghiên cứu đầu tiên công bố về khảo sát hoạt độ của hệ enzyme các chủng Trichoderma phân lập được tại các vùng kể trên. Các khảo sát trên đĩa Petri chỉ có thể so sánh trực tiếp các nghiệm thức ở cùng thời điểm trong một thí nghiệm, nên nhóm tác giả chỉ có nhận định mang tính ước lượng sơ khởi về khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme và so sánh ước lượng trong phạm vi giữa các chủng này như
trên.
Bảng 3.10. Các chủng Trichoderma có tổ hợp enzyme cellulase, chitinase, β-glucanase, xylanase, mannanase và protease với hoạt độ cao nhất trong bộ giống
Chủng Hđ Cellulase (mm) Hđ Chitinase(mm) Hđβ-glucanase(mm) Hđ Xylanase(mm) Hđ Mannanase (mm) Hđ Protease(mm) L5 42,5 ± 2,1 41,5 ± 0,7 53,5 ± 0,7 48,0 ± 1,4 76,0 ± 1,4 29,0 ± 0 B7 31,5 ± 2,1 55,0 ± 0 60,5 ± 0,7 45,0 ± 0 54,0 ± 1,4 38,0 ± 0 L7 37,0 ± 1,4 46,0 ± 0 42,5 ± 0,7 50,0 ± 1,4 78,0 ± 1,4 33,5 ± 0,7 L10 40,5 ± 0,7 45,5 ± 0,7 56,5 ± 0,7 39,5 ± 0,7 31,0 ± 1,4 32,0 ± 0 B8 29,0 ± 1,4 57,0 ± 0 10,0 ± 0 39,5 ± 0,7 52,5 ± 0,7 46,0 ± 0 B25 30,5 ± 0,7 52,0 ± 0 41,5 ± 0,7 39,0 ± 1,4 67,0 ± 0 31,0 ± 0 * Hđ: Hoạt độ.
3.4.9. Khảo sát mối tương quan về hoạt độ trung bình giữa các hệ enzyme phân giải polysaccharid giải polysaccharid
Hoạt độ trung bình là trung bình cộng giá trị hoạt độ enzyme (được tính bằng đường kính vòng phân giải) của các chủng Trichoderma khảo sát. Việc khảo sát mối tương quan về hoạt độ trung bình giữa các hệ enzyme sẽ giúp những nghiên cứu liên quan có thể dựa vào kết quả của một enzyme để đưa ra nhận định cho những enzyme có mối tương quan với nó mà không cần phải thực hiện thêm các thí nghiệm tương tự.
Đối với hoạt độ trung bình của cellulase và chitinase: Qua xử lý thống kê, kết quả
cho thấy: Z = 2,12. Như vậy, với Zα = 1,96 đã biết, Z > Zα: bác bỏ giả thuyết H0, tức là hoạt độ trung bình cellulase không có mối tương quan với hoạt độ trung bình chitinase. Điều này có thể lý giải do hệ cellulase có khả năng phân giải cơ chất chitin, trong khi đó chitinase không có khả năng phân giải cơ chất cellulose.
47
Đối với hoạt độ trung bình của cellulase và β-glucanase: Kết quả xử lý thống kê thu
được Z = 1,20. Do đó, Z < Zα: chấp nhận giả thuyết H0, hoạt độ trung bình cellulase có mối tương quan với hoạt độ trung bình β-glucanase. Hệβ-glucanase bao gồm các enzyme thủy phân các liên kết β-1,2; β-1,3; β-1,4; β-1,6 của β-glucan, trong khi đó hệ cellulase thủy phân đặc hiệu liên kết β-1,4 của β-glucan. Cho nên kết quả này phù hợp theo lý thuyết.
Đối với hoạt độ trung bình của chitinase và β-glucanase: Kết quả xử lý thống kê thu
được Z = 2,73. Như vậy, Z > Zα: bác bỏ giả thuyết H0, chấp nhận H1, tức là hoạt độ
trung bình chitinase không có mối tương quan với hoạt độ trung bình β-glucanase.
3.5. Đánh giá khả năng đối kháng của Trichodermađối với một số loài nấm gây bệnh cây trồng điển hình bệnh cây trồng điển hình
3.5.1. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Sclerotium rolfsii
Hình 3.4. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Sclerotium rolfsii, 1+: Bào tử
Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bịức chế và tàn lụi dần, hiệu quảức chế từ 40-60%; 2+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 60-80%; 3+: Tương tự (1+), hiệu quảức chế 80-90%; 4+: Tương tự (1+), hiệu
48 0 5 10 15 20 25 30 35 _ 1+ 2+ 3+ 4+ Mức độđối kháng S ố l ượ ng ch ủ n g 5 ngày 13 ngày
Biểu đồ 3.8. Mức độđối kháng của các chủng Trichodermađối với Sclerotium rolfsii
Sau 5 ngày khảo sát đối kháng chỉ 15 chủng Trichoderma đối kháng được với S.
rolfsii ở mức 1+ (hay 40 – 60%), số còn lại không đối kháng. Tuy nhiên, sau 13 ngày khảo sát (thời điểm ghi nhận mức độ đối kháng tối đa S. rolfsii của các chủng