2.4.1.1. Phương pháp kiểm tra và xác định nguyên nhân gây bệnh
Mẫu bệnh cà chua sau khi thu thập ngoài đồng ruộng, rửa sạch bằng nước sau đó rửa lại bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô. Sau 1 - 2 ngày bào tử nấm mọc ra, kiểm tra dưới kính hiển vị, dựa vào tài liệu sau để phân loại, chẩn đoán giám
định các loài nấm gây hại.
-H.L. Barnet, Bany B.Hunter,1998, Illusstrated Genera of Imperfect Fungi, The American Phytopathologycal Society Press, P.61 - 178
- J.B.Jone,R.E.Stall,T.A.Zitter,1993, Compendium of Tomato Diseases.The American Phytopathologycal Society Press, p.9-24
2.4.1.2 Phương pháp chế tạo môi trường
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường nhân tạo PSA, PGA, WA, một số môi trường bán tự nhiên như lá cà chua – aga, lá cà chua – cám, PSA + lá cà chua, PGA + lá cà chua để nuôi cấy và nghiên cứu một số đặc điểm của nấm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18
2.4.1.3. Phương pháp phân lập nấm A. solani và S. solani
Theo phương pháp cấy đơn bào tử, nhờ sự trợ giúp của kim thủy tinh trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 20 x 10, cách phân lập như sau:
Chọn mẫu bệnh điển hình, sửa sạch dưới vòi nước, sau đó rửa bằng nước cất vô trùng, dùng giấy lọc vô trùng thấm khô, để mẫu lá bệnh trong hộp ẩm ở 26oC trong 2 ngày trên vết bệnh xuất hiện nhiều bào tử. Dính nhẹ vết bệnh có bào tử vào vị trí đã đánh dấu trên mặt đĩa WA. Úp ngược đĩa WA lên kính hiển vi quang học, quan sát bào tử và dùng kim thủy tinh nhẹ nhàng dính từng bào tử vào đầu kim, mỗi bào tửđược cấy vào một điểm trên đĩa WA, đưa đĩa WA vào buồng cấy, dùng que cấy cắt miếng WA có bào tử cấy vào ống nghiệm nghiêng PSA. Từ một bào tử nấm sẽ phát triển kín mặt môi trường PSA trong ống nghiệm. Đây là nguồn nấm thuần
để dùng thí nghiệm.
2.4.1.4. Xác định nguyên nhân gây bệnh đốm vòng và đốm nâu hại cà chua
Sau khi đã tạo được nguồn nấm thuần khiết, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng.
- Từ các cây bị nhiễm bệnh nhân tạo hình thành triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành phân lập lại mô bệnh trên môi trường nhân tạo (theo quy tắc Koch).
- Mô tả, so sánh đặc điểm và hình thái và màu sắc của sợi nấm, tản nấm, đĩa cành, kích thước đĩa cành và bào tử nấm gây bệnh đốm vòng và đốm nâu hại cà chua.
- Dựa vào các đặc điểm về hình dạng, màu sắc kích thước bào tử, sợi nấm và tản nấm căn cứ vào tài liệu:
+ H.L. Barnet, Bany B.Hunter, 1998, Illusstrated Genera of Imperfect Fungi, The American Phytopathologycal Society Press, P.61 - 178
+ J.B.Jone, R.E.Stall, T.A.Zitter,1993, Compendium of Tomato Diseases. The American Phytopathologycal Society Press, p.9-24 để xác định loài nấm gây bệnh đốm vòng A. solani và đốm nâu S. solani hại cà chua.
2.4.1.5. Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sinh trưởng của sợi nấm A. solani và S. solani
- Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết. Dùng đột, đột khoanh nấm có đường kính 5 mm. Cấy nấm vào giữa hộp petri trên các môi trường PSA, PGA, môi trường
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
cám gạo, môi trường PSA + lá cà chua, môi trường cám gạo + lá cà chua + aga, môi trường aga + lá cà chua không lọc.
- Mỗi môi trường có 03 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp peri. * Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hình thái, màu sắc tản nấm.
+ Đo đường kính tản nấm sau cấy 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày. + Đơn vịđo (mm).
2.4.1.6. Nghiên cứu khả năng nảy mầm của nấm A. solani và S. solani trong nước cất
Hòa bào tử vào nước cất. quan sát sau 2h, 6h, 12h, 24h bằng cách là nhỏ 1 giọt dung dịch vào buồng đếm hồng cầu sau đó đậy lamen. Đặt buồng đếm hồng cầu vào kính hiển vi quang học, đếm số lượng bào tử trên trong mỗi ô. Đếm số bào tử và số bào tử nảy mầm trên 5 ô trên quang trường .
Tổng số bào tử nầy mầm
% bào tử này mầm = ---
Tổng số bào tửđếm được
2.4.1.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thuốc đến tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm A. solani, S. solani trên môi trường PSA
Nấu môi trường PSA, hấp vô trùng, để nguội 500C
- Hòa thuốc ở lượng cần thiết vào 5 ml nước vô trùng lắc đều, sau đó đổ vào 100 ml môi trường PSA để nguội ở 500C, lắc đều, sau đó đổ ra 3 đĩa Petri để nguội bọc màng polyetylen kín miệng hộp.
Cho 1 ml nước cất vô trùng vào efdopt, dùng que cấy nấm lấy 1 lượng bào tử
hòa vào cho đều. Hút 100 µl cho vào môi trường và trang đều lên mặt đĩa môi trường PSA.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Đếm số lượng bào tử, số bào tử nảy mầm trong 1 quang trường 10x10. Bào tử có mầm bằng 2/3 chiều dài bào tử được tính là bào tử nảy mầm.
Chỉ tiêu theo dõi : Số lượng bào tử này mầm 2 giờ, 4 giờ, 10 giờ , 24 giờ. Công thức thí nghiệm:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 STT Công thức thí nghiệm Nồng độ (%) 1 Ridomil gold 68WG 0,05 2 Antracol 70 WP 0,05 3 Score 250 EC 0,05 4 Đối chứng ( Nước cất)
2.4.1.8. Nghiên cứu khả năng gây bệnh nhân tạo của nấm A.solani và S. solani trên
giống cà chua HT144 trong nhà lưới.
Tiến hành lây bệnh trên tất cả các bộ phận của cây cà chua giống HT144 gồm : lá, cành, thân, quả.
Khi tiến hành lây ở bộ phận nào thì chọn những bộ phận đó với điều kiện những bộ phận đó không có vết bệnh, không bị sâu hại hoặc vết nứt. Sau khi lây bệnh tiến hành theo dõi sốđiểm phát bệnh từđó tính tỷ lệ phát bệnh.
*Phương pháp lây:
- Phân lập nguồn nấm thuần trên đĩa petri.
- Đối với công thức lây nhiễm có sát thương, dùng đầu kim tiêm gây sát thương cho bộ phân cần lây nhiễm.
- Lấy que cấy cắt miếng thạch nhỏ áp lên bộ phận cần lây nhiễm. - Lấy băng chống nhện đậy lên miếng thạch để cốđịnh miếng thạch.
* Đánh giá khả năng gây bệnh nhân tạo của nấm A. solani và S. solani trên giống cà chua HT 144 trong nhà lưới
+ Mỗi bộ phận lây 30 vết trên 10 cây.
Từđó tính số điểm phát bệnh sau khi lây bệnh từđó tính tỷ lệ phát bệnh sau khi lây bệnh.