2.4.1 Sơ lược về vi khuẩn lactic.
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật. Lên men lactic có hai dạng: điển hình hoặc đồng hình và không điển hình hoặc dị
hình (Lương Đức Phẩm, 2002).
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium, là vi
khuẩn Gram (+). Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn, đa số không sinh bào tử, thường không chuyển động và kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, chúng không chứa cytochrom và enzyme catalase, chúng có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh, phân giải H2O2 để phát triển. Đa số chúng lên men được mono và disaccharide, một số không lên men được saccharose, số khác không lên men được đường maltose. Các vi khuẩn lactic không có khả năng lên men tinh bột
và các polysaccharide khác (chỉ có loài L. delbruckii là đồng hóa được tinh bột).
Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu, hình oval và hình que, đường kính của dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5 μm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 μm, trực khuẩn thường đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.
Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau tạo thành acid trong môi trường và sức chịu đựng acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển được ở pH = 4-3,8 còn cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5-6. Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình) rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin (B1, B2, B6, PP, các acid pantotenic và acid folic),…
Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, chúng phân hủy được protein của sữa tới peptide và acid amin. Hoạt tính này ở các loài có khác nhau, thường trực khuẩn là
cao hơn. Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn ethylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl tới 7-10%. Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25 – 35oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu là 40 – 45oC, loài ưa lạnh có thể phát triển được ở nhiệt độ tương đối thấp (khoảng 5oC hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60 – 80oC hầu hết chúng bị chết sau 10-30 phút.
(Lương Đức Phẩm, 2002).
Lên men Lactic đồng hình
Sự lên men tạo ra sản phẩm chính là acid lactic 90 – 98% tổng sản phẩm lên men, sản phẩm phụ là etanol, acid acetic, rượu ethylic, CO2, axetoin…
Gồm một số loại vi khuẩn sau: Streptococcus lactic, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus phantarum, Lactobacillus acidophilum….
Nhóm vi khuẩn lactic điển hình có khả năng phân hủy đường theo con đường đơn giản và tạo ra sản phẩm chủ yếu là acid lactic. Đây là quá trình lên men lactic điển hình hay còn gọi là lên men lactic đồng hình:
Lên men Lactic dị hình
Lên men lactic còn gọi là lên men không điển hình và phức tạp hơn, sản phẩm cuối cùng ngoài acid lactic còn nhiều sản phẩm phụ: acid acetic, rượu ethylic, CO2, dextran…
Gồm có một số loại vi khuẩn sau: Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus pentoaceticus, Lactobacillus berevis…
Số lượng các sản phẩm phụ phụ thuộc hoàn toàn vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Thông thường, nhóm vi khuẩn lên men dị hình cho 40% acid lactic, acid succinic gần 20%, acid acetic 10%, rượu ethylic 10% và các loại khí 20%.
2.4.2 Các chủng vi sinh vật sử dụng trong Yaourt
Chủng giống dùng trong sản xuất yaourt là hỗn hợp trộn của hai loại vi sinh vật
Streptococcus thermophiles và Lactobacillus bulgaricus. Lactobacillus bulgaricus (L.bulgaricus)
Là vi khuẩn lên men dị hình, trực khuẩn gram dương, hình que, dài, mảnh, không có khả năng di chuyển và phát triển tốt ở nhiệt độ 45 – 50oC trong môi trường có độ acid cao( Lương Đức Phẩm, 2003). Loại này có thể tạo ra trong khối sữa đến 2,7%
C6H12O6 (Đường)
2CH3-CHOH-COOH
acid lactic từ đường lactose. Nó làm đông tụ sữa ở 37oC, có thể lên men được đường lactose, glucose và galactose. Nó thuộc loại kị khí không bắt buộc, pH thích hợp ở 5,4. Khi lên men chúng không có khả năng sử dụng đường maltose và tạo một lượng nhỏ acid bay hơi và aldehyde, tạo cho sản phẩm có mùi vị đặc trưng, thường dùng để sản xuất yaourt đông mịn.
Streptococcus thermophillus (S.thermophillus)
Phát triển tốt ở nhiệt độ 50oC và sản sinh tốt ở nhiệt độ 37 – 40oC. Đây cũng là vi khuẩn lactic chịu nhiệt lên men điển hình, có thể chịu được nhiệt độ đun nóng đến 65oC trong 30 phút nhưng chỉ phát triển được trong môi trường acid thấp hơn
L.bulgaricus ( Lương Đức Phẩm, 2003).
Đối với chủng này môi trường dung dịch và nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hình thái của chúng. Trong sữa ở nhiệt độ 45oC, nó tạo thành những chuỗi ngắn và ở nhiệt độ 30oC, nó có dạng cầu đôi. Streptococcus thermophiles có thể tạo thành
những chuỗi dài ở nồng độ acid cao trong sữa. Nó sản xuất acid lactic từ đường với hàm lượng từ 85 – 98% và một lượng nhỏ các sản phẩm phụ khác.
Lactose
Glucose Galactose
Sản phẩm trung gian Acetaldehyde CH3CHO C2H5OH Acid Pyruvic CH3COCOOH +1/2 O2 +H2O +2H + H
Acid lactic Acid lactic CO2+ CH3COOH
+CO2, CH3CHO +1/2 O2 Aceton CH3COCHOHCH3 - 2H Diacetyl CH3COCOCH3 CH3COOH Lên men dị thể Lên men Đồng thể
Hình 2.3 Tóm lược sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men sữa
Streptococcus thermophiles phát triển nhanh và tạo ra cả acid lẫn khí CO2. Khí CO2
và fomate được tạo ra nhằm kích thích cho L. bulgaricus phát triển. Mặt khác, hoạt động thủy phân protein của L. bulgaricus tạo ra peptide và acid amin cần cho sự phát triển của Streptococcus thermophiles.
Những vi sinh vật lên men lactic chịu trách nhiệm trong việc hình thành hương vị và cấu trúc của yaourt. Khối lượng yaourt đông tụ trong quá trình lên men do pH giảm xuống.
S. thermophiles chịu trách nhiệm đối với việc giảm pH lúc đầu khoảng pH = 5,0 L. bulgaricus là giảm pH xuống thấp hơn pH = 4,0.
Những sản phẩm tạo hương cho yaourt sau quá trình lên men: acid lactic, acetaldehyde, acid acetic, diacetyl.
Hình 2.4 Vi khuẩn Streptococcus thermophiles và Lactobacillus bulgaricus
(Nguồn: www.Sinhhocvietnam.com)
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Trong công nghiệp sản xuất yaourt, các giai đoạn xử lí sản phẩm sau quá trình lên men thường đơn giản. Sản phẩm cuối cùng bao gồm cả sinh khối vi sinh vật, các sản phẩm trao đổi ngoại bào do vi sinh vật tiết ra và cơ chất. Thành phần và hàm lượng từng chất sẽ góp phần hình thành nên hương vị cho sản phẩm. Do đó, để sản xuất được yaourt với chất lượng mong muốn cần chú ý các yếu tố sau:
Chọn giống vi khuẩn thích hợp.
Sử dụng môi trường lên men với thành phần cơ chất đầy đủ theo tỉ lệ tối ưu.
Lên men trong điều kiện thích hợp như: lượng giống cấy, nhiệt độ và thời gian lên men. Ngoài ra, ta còn phải quan tâm đến những vấn đề khác như việc cung cấp oxy, sự khuấy trộn…
Chương 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ tháng 1/2014 đến tháng 5/2014
Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng – Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Bếp gas Bếp gas
Máy xay đậu nành
Chiết quang kế (hiệu ATAGO, 0-32o Brix, Japan)
Cân điện tử (Vibra, d=0.01, Adventurer, d=0.0001, Trung Quốc) Nhiệt kế
pH kế
Máy ly tâm lạnh
Máy đo cấu trúc Rheo – tex (Nhật). Tủ sấy (Sibata SD-600, Nhật). Tủ cấy vô trùng (Dalton, Nhật). Tủ ủ vi sinh (Sanyo Mir-262, Nhật). Thiết bị tiệt trùng (Sturday, Đài Loan). Vortex V1 plus (Đức).
Tủ ủ (Langshan, Trung Quốc).
Micropipet 100-1000 µ ml (Đức).
Các dụng cụ thí nghiệm khác như: ống đông, buret, ống nghiệm, đĩa petri, trang cấy, đèn cồn, đũa thủy tinh…
3.1.3. Hóa chất
Dung dịch NaOH 0,1N Phenoltalein 1%
Môi trường MRS Nước muối sinh lý Cồn 70o
Cồn 90o
3.1.4. Nguyên liệu làm sản phẩm
Đậu nành: Giống đậu 760 được mua ở bộ môn trồng trọt Khoa Nông nghiệp – Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, Cần Thơ.
Sữa tươi Long Thành: Mua ở cửa hàng bán sữa đường 3/2, phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ.
Đường cát trắng: Mua ở chợ Xuân Khánh.
Giống men thương mại YC381 (thermopphillic yoghurt culture) công ty CHR HANSEN
3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.2.1 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm được bố thí hoàn toàn phân lập và ngẫu nhiên với 2-3 lần lặp lại. Khảo sát từng thí nghiệm riêng lẻ, đo đạc, phân tích và ghi nhận kết quả. Sử dụng thông số tối ưu của thí nghiệm trước áp dụng cho thí nghiệm sau.
Kết quả được tính toán và xử lý thống kê theo chương trình Statgraphics plus. 3.2.2. Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
3.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Nguyên liệu đậu nành được mua cùng một giống có nguồn gốc. Lựa chọn đậu nành phải đồng nhất, không bị sâu bệnh, không có những đốm màu đen trên hạt.
3.2.2.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu là nguyên liệu đậu nành được mua về và lạm sạch, loại bỏ tạp chất…, đậu được ngâm 8 -10 giờ dưới vòi nước chảy tràn, tiếp theo là loại bỏ vỏ đậu nành, sau đó đem xay bằng máy xay và lọc lấy được dịch sữa đậu nành.
3.2.3 Phương pháp phân tích
Các phương pháp phân tích các chỉ tiêu lý – hóa học và vi sinh vật của nguyên liệu và sản phẩm yaourt đậu nành. Đánh giá cảm quan sản phẩm theo mô tả từng thuộc tính của sản phẩm, bao gồm: trạng thái, cấu trúc, mùi vị. Mỗi thuộc tính được xây dụng theo thang điểm từ 0 đến 5.
Bảng 3.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng của yaourt
Chỉ tiêu đánh giá Phương pháp xác định Đo pH Sử dụng pH kế đo trực tiếp khối đông yaourt.
Độ ẩm (%) Xác định bằng phương pháp sấy tới khối lượng không đổi, từ độ ẩm suy ra tổng chất khô có trong nguyên liệu.
Đo acid lactic sinh ra (%)
Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi pH đạt 8,3 (Lê
Thanh Mai và ctv, 2009)
Độ cứng (gram force), (đo cấu trúc)
Chuẩn bị mẫu yaourt có chiều cao 20mm được chứa trong hũ nhựa có đường kính 70mm. Sử dụng máy RHEOTEX, đầu đo hình tròn (đường kính 20mm). Cố định khoảng cách đâm thủng của đầu đo vào mẫu là 4mm.
Độ tách nước (%)
Sử dụng máy ly tâm Sigma 4K15 centrifuge (Strius AG, Gottigen, Germany). Yaourt (20–25g) được ly tâm với tốc độ 5000 rpm, nhiệt độ 4oC trong 10phút (Rodarte et al., 1993 trích dẫn từ Lee và Lucey, 2010).
Vi khuẩn lactic (CFU/g)
Phương pháp đếm mật số vi khuẩn lactic trên môi trường MRS Agar (Tamime và Robinson, 1999)
3.3 QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM3.3.1 Quy trình sản xuất 3.3.1 Quy trình sản xuất
Hình 3.1 Quy trình thí nghiệm yaourt đậu nành 3.3.2 Thuyết minh quy trình thí nghiệm
Nguyên liệu
Chọn nguyên liệu đậu nành thường là đậu phải đạt độ chín chế biến, ruột vàng, vỏ mỏng, da láng. Loại bỏ những hạt hư do sâu, mọt, mối… hạt kém phẩm chất (hạt non, hạt không bình thường về màu sắc và hình dạng…) những hạt này sẽ làm cho sản phẩm kém chất lượng.
Xử lý sơ bộ
Đậu nành
Xử lý sơ bộ
Sữa tươi, đường
Cấy giống Dịch sữa đậu nành Phối chế Thanh trùng Làm nguội Ủ lên men Sản phẩm Bảo quản Men giống
Xử lý hạt đậu nành ra dịch sữa đậu nành cần xử lý qua các công đoạn sau:
+ Ngâm: hạt đậu nành cần hút nước và trương lên, do các phân tử nước tác động lên các cấu tử ưa nước trong hạt. Ngâm đậu nành cần phải ngâm dưới vòi nước chảy tràn để hạn chế hiện tượng chất tan trong hạt tan vào nước làm giảm pH của dịch sữa.
Thời gian ngâm đậu là 8 - 10 giờ.
Công đoạn ngâm còn giúp cho quá trình bóc vỏ và xay dễ dàng hơn.
+ Bóc vỏ: làm sạch nguyên liệu, làm dịch sữa đậu nành trắng hơn và giảm bọt khi lọc.
+ Xay: là phá vỡ cấu trúc tế bào của hạt đậu nành để trích ly các chất dinh dưỡng (protein, gluxid, lipid…) vào trong nước tạo thành một dung dịch huyền phù. Xay đậu bằng máy xay ướt và xay với lượng nước vừa phải.
+ Lọc: là loại bỏ bã, thu được dịch sữa đậu nành.
Cho dịch sữa sau khi xay vào vải lọc sạch, dịch sữa qua vải lọc dùng để chế biến sản phẩm. Quá trình lọc quyết định đến hiệu suất thu hồi sản phẫm, dịch sữa thu được phải đảm bảo tiêu chuẩn hàm lượng các chất khô. Sau khi lọc xong dịch sữa có màu trắng đặc trưng của sữa đậu nành, không có cặn hay lợn cợn làm giảm giá trị cảm quan cho sản phẩm.
Phối chế
Để quá trính lên men Yaourt tốt hơn, và tạo ra sản phẩm có mùi vị thích hợp ta cần phối chế thêm sữa tươi và đường cho sản phẩm. Tỉ lệ phối chế sữa đậu nành, sữa tươi và đường theo những tỉ lệ nhất định.
Thanh trùng
Mục đích của quá trình thanh trùng là tiêu diệt vi sinh vật và vô hoạt enzyme. Ngoài ra, có thể làm giảm bớt mùi hăng của đậu nành tươi.
Làm nguội
Giúp cho quá trình cấy men tốt hơn, nhiệt độ làm nguội là 40-45oC Cấy giống men
Mục đích là cung cấp men cho quá trình lên men yaourt đạt chất lượng tốt phải chọn men giống thích hợp với sản phẩm. Sau khi làm nguội dịch sữa đến nhiệt độ thích hợp thì cho men giống vào.
Khi cấy men giống xong ta đem dịch sữa rót hũ nhỏ và ủ ấm sản phẩm. Nhiệt độ ủ 43oC và ủ trong 3 giờ để tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển, lên men sản phẩm, tạo acid giảm pH, định hình sản phẩm.
Bảo quản
Sản phẩm sau khi lên men đạt yêu cầu thì đem sản phẩm đi bảo quản lạnh ở nhiệt 4oC.
3.4 NỘI DUNG VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu yaourt đậu nành
Đậu nành
Xử lý sơ bộ
Sữa tươi, đường
Cấy giống Dịch sữa đậu nành Phối chế A1: 12%, A2: 13%, A3: 14% chất khô Thanh trùng ( To=85- 90oC, 10-15 phút) Làm nguội ( To = 43oC)
Ủ lên men ( T0 = 43oC, thời gian 3 giờ)
Sản phẩm
Bảo quản, To =4oC Men giống
B1: 0,04; B2: 0,06; B3:0,08; B4:0,1 (g men giống/kg dịch sữa)
- Ngâm: 8-10h - Bóc vỏ
- Xay: đậu: nước; 1:8 - Lọc bỏ bã
C2: 7 ngày
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khô sản phẩm đến chất lượng sản phẩm đến chất lượng sản phẩm
3.4.1.1 Mục đích thí nghiệm
Tìm ra hàm lượng chất khô của sản phẩm khi phối chế giữa sữa đậu nành, sữa tươi, đường để chọn sản phẩm có cấu trúc, màu sắc và mùi vị tốt nhất, mang lại giá trị kinh tế cho sản phẩm.
3.4.1.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên gồm một nhân tố với ba lần lặp lại. Nhân tố A: % chất khô
Khảo sát ảnh hưởng của % chất khô đến chất lượng sản phẩm. A1: 12%
A2: 13% A3: 14%
3.4.1.3 Tiến hành thí nghiệm
Dịch sữa lên men từ hai loại nguyên liệu là dịch sữa đậu nành, sữa tươi được phối chế với đường để đạt hàm lượng chất khô mong muốn.
Hỗn hợp được đem thanh trùng ở nhiệt độ 85- 90 trong 15 phút, sau đó làm nguội xuống 43 - 45oC và cấy men giống đã được vô hoạt khuấy điều, rót hũ và ủ lên men sản phẩm ở 43oC trong 3 giờ. Trong theo gian ủ lên men cần theo dõi sự giảm pH của dịch sữa. Đo pH sản phẩm là 1 giờ đo 1 lần. Sản phẩm đạt pH = 4,6. Lấy sản phẩm cho vào tủ lạnh (nhiệt độ khoảng 4oC) để sản phẩm ổn định. Sau 24 giờ đem sản phẩm theo dõi các chỉ tiêu và theo dõi sản phẩm.
3.4.1.4 Kết quả ghi nhận
pH sản phẩm
Hàm lượng acid (tính theo acid lactic) sinh ra theo thời gian lên men. Khả năng giữ nước của sản phẩm.
Đánh giá cảm quan sản phẩm theo trạng thái, cấu trúc, màu sắc, mùi vị.