4.3.1. Kết quả PCR của mồi Thraus-Schi1 (khoảng 500bp)
Thực hiện phản ứng PCR với mồi Thraus-Schi1 với chu kỳ nhiệt ở Bảng 5. Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1,5% Agarose:
Hình 13. Kết quả sản phẩm PCR bằng cặp mồi Thraus-Schi1 được điện di trên gel 1,5% Agarose.
(Từ giếng 1 đến giếng 9 lần lượt là các dòng: B1, B3, M6, M3, M7, M8, M19, M10 và D14. Giếng 10 là đối chứng âm. Giếng cuối (giếng 12) là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas)
Dựa vào kết quả phân tích điện di trên gel Agarose ở Hình 13 cho thấy, các cặp mồi được thiết kế trong nghiên cứu này đã khuyếch đại sản phẩm PCR với kích thước khoảng 500bp đúng với kích thước đoạn gen theo lý thuyết và tất cả các dòng được cung cấp trong thí nghiệm này đều được kiểm tra bằng cặp mồi này và tất cả đều cho ra sản phẩm PCR khoảng trên 500bp. Dựa vào đó cho thấy rằng chín dòng vi tảo này đều thuộc về hai chi Thraustochytrium và Schizochytrium.
Gen mã hóa 18S rDNA là gen được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu cho các loại vi sinh vật nhân thực. Trước đây, Mo et al. (2002) cũng đã sử dụng kỹ thuật PCR để nhận diện 26 dòng thraustochytrid đã được phân lập. Theo Chatdumrong et al. (2007), cặp mồi NS1 và NS8 được sử dụng để khuyếch đại vùng gen 18S rDNA nhằm nhận diện chủng BR2.1.2 là Thraustochytrium aggregatum hay Schizochytrium limacinum. Trong nghiên cứu của Dương Tấn Phát (2013), cặp mồi 1F và 536R đã được thiết kế để nhận diện các dòng vi tảo thraustohytrid phân lập được từ các mẫu lá ở vùng ngập mặn Cà Mau với kích thước khoảng 530-540bp. Vì vậy, kỹ thuật sinh học phân tử mang lại hiệu quả đáng kể trong việc nhận diện vi tảo thraustochytrid.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
4.3.2. Kết quả PCR của mồi Thraus-Schi2 (khoảng 1000bp)
Phản ứng PCR được thực hiện với chu kỳ nhiệt như ở Bảng 6 và sản phẩm điện di trên gel 1,5% Agarose
Hình 14. Kết quả điện di trên gel Agarose 1,5% với mồi Thraus-Schi2
(Giếng 1 là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas, giếng 2 đến giếng 5 lần lượt là dòng B3, D14, M6 và M10, giếng 6 là đối chứng âm)
Kết quả điện di (Hình 14) cho thấy sản phẩm PCR đã khuếch đại một band khoảng 1.000bp đúng như tính toán lý thuyết tuy nhiên các band rất mờ, do đó cần cải thiện điều kiện thực hiện phản ứng PCR.
Thay đổi chu kỳ nhiệt: để cải thiện sản phẩm PCR, thực hiện phản ứng PCR với các chu kỳ nhiệt khác nhau, trong đó thay đổi nhiệt độ giai đoạn bắt mồi trong khoảng từ 56°C đến 52°C và so sánh kết quả điện di trên gel Agarose 1,5%.
Bảng 11. Chu kỳ nhiệt tối ưu hóa cho mồi Thraus-Schi2
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 4 phút 1 2 94 56-52 72 45 giây 45 giây 2 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1 1000bp 1 2 3 4 5 6
Kết quả điện di cho thấy band xuất hiện rõ và sáng ở nhiệt độ bắt mồi là 52°C.
Hình 15. Kết quả điện di trên gel Agarose của mồi Thraus-Schi2 ở nhiệt độ bắt mồi là 52°C
(Giếng 2 đến giếng 6 lần lượt là dòng B3, D14, M6 và M10, giếng 1 là đối chứng âm và giếng 6 là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas)
Tiếp tục thực hiện phản ứng PCR với 9 dòng vi tảo theo chu kỳ nhiệt đã được tối ưu. Dựa vào kết quả điện di (Hình 16) cho thấy rằng 9 dòng vi tảo đều có cùng sản phẩm PCR với 1.000bp. Kết quả này cùng với kết quả phân tích bằng cặp mồi Thraus- Schi1 đã trình bày ờ trên một lần nữa cho thấy các dòng vi tảo này đều thuộc nhóm
Thraustochytrium và Schizochytrium.
Hình 16. Kết quả điện di trên gel Agarose với 9 dòng vi tảo bằng mồi Thraus-Schi2
(Từ giếng 1 đến giếng 9 lần lượt là các dòng: B1, B3, M6, M3, M7, M8, M19, M10 và D14. Giếng 10 là đối chứng âm. Giếng cuối (giếng 11) là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas)
4.3.3. Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium (khoảng 600bp) 600bp)
Thực hiện phản ứng PCR với mồi Schi1 với chu kỳ nhiệt ở Bảng 7
1 2 3 4 5 6
1000bp
Sản phẩm được điện di trên gel Agarose 1,5%
Hình 17. Kết quả sản phẩm PCR với mồi Schi điện di trên gel 1,5% Agarose
(Từ giếng 1 đến giếng 9 lần lượt là các dòng: B1, B3, M6, M3, M7, M8, M19, M10 và D14. Giếng 10 là đối chứng âm. Giếng cuối (giếng 11) là thang chuẩn 800bp)
Dựa vào kết quả điện di trên gel Agarose 1,5% (Hình 17) cho thấy có 7 dòng đã khuếch đại được sản phẩm PCR với kích thước 600bp đúng như lý thuyết, điều này có thể nhận định được rằng trong số 9 dòng vi tảo thì có 7 dòng thuộc Schizochytrium
(bao gồm: dòng B1, B3, M3, M6, M7, M8 và M10). Kết hợp với kết quả nhận diện của 2 cặp mồi Thraus-Schi1 và Thraus-Schi2 cho thấy dòng D14 và M19 thuộc chi
Thrasutochytrium
4.3.4. Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium striatum
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng vi tảo
Thraustochytrium striatum với chu kỳ nhiệt ở Bảng 8. Sản phẩm được điện di trên gel Agarose 1,5%
Phản ứng PCR được thực hiện với nhiệt độ bắt mồi được thay đổi trong khoảng từ 52°C đến 56°C, nhưng kết quả tất cả 9 mẫu DNA đều không có band khoảng 531 xuất hiện. Như vậy, chín dòng vi tảo đều không thuộc loài vi tảo là Thraustochytrium striatum. Kết hợp với kết quả của cặp mồi chuyên biệt cho dòng Schizochytrium cho thấy, 7 dòng vi tảo thuộc dòng Schizochytrium, chỉ có 2 dòng D14 và M19 thuộc chi
Thraustochytrium. Từ đó cho thấy 2 dòng vi tảo D14 và M19 đều không thuộc
Thraustochytrium striatum. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 800bp bv p 600bp bv p
4.3.5. Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium aureum
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng vi tảo
Thraustochytrium aureum với chu kỳ nhiệt ở Bảng 9. Sản phẩm được điện di trên gel Agarose 1,5%.
Phản ứng PCR được thực hiện với nhiệt độ bắt mồi được thay đổi trong khoảng từ 52°C đến 56°C, nhưng kết quả tất cả 9 mẫu DNA đều không có band khoảng 545 xuất hiện. Như vậy, chín dòng vi tảo đều không thuộc loài vi tảo Thraustochytrium aureum. Kết hợp với kết quả của cặp mồi chuyên biệt cho dòng Schizochytrium cho thấy, có 7 dòng đều thuộc dòng Schizochytrium, chỉ có 2 dòng D14 và M19 thuộc chi
Thraustochytrium. Từ đó cho thấy 2 dòng vi tảo D14 và M19 đều không thuộc
Thraustochytrium aureum.
4.4. Giải trình tự
Ba dòng vi tảo B3, M6 và D14 được tiếp tục sử dụng để giải trình tự nhằm kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi chuyên biệt đã thiết kế. Việc lựa chọn 03 dòng vi tảo này dựa trên những cơ sở sau: Thứ nhất, ba dòng vi tảo này được phân lập từ 3 loại lá khác nhau là lá bần (dòng B3), lá đước (dòng D14) và lá mắm (dòng M6). Thứ hai, các mẫu lá được lấy từ 2 tỉnh khác nhau là Bến Tre (B3 và M6) và Trà Vinh (D14). Thứ ba, dựa vào kết quả phân tích bằng cặp mồi chuyên biệt đã thiết kế trong nghiên cứu này, dòng B3 và M6 thuộc chi Schizochytrium và dòng D14 thuộc chi Thraustochytrium. Thêm vào đó, cả 3 dòng vi tảo này đều có khả năng sản xuất được DHA và DPA khá cao (Theo báo cáo của Trần Thị Xuân Mai et al., 2014)
Sản phẩm PCR của 3 dòng vi tảo B3, D14 và M6 bằng cặp mồi Thraus-Schi2 (khoảng 1.000bp) được đem giải trình tự.
Kết quả trình tự: - Dòng B3: CCAAGCATATGCCAAAACGTGTGCCACATAAAAAAGCTNGTANGTAA ATTTTCTGCGATGGGCGANCGGGTGGTCTCTCCCTGAANGGGGATGAATTN NCNGGTGCCTTNGCCCATTTTTTCTTCTTTTNGGGGGAGAATTTTTCACTGA AAACAAACAAGGTTTCCCAAACCAGGTTTTTGACCCGGATATTTTTTTTAG GGAAAAAAGAAAGGGCTTGGGGGGCTTTTTTTTGGTTTCCCCCCCTGAAAA AGGTTAAAAGGAACACTTGGGGGGATTTGTTTTTTGGGGCTTAGGGGGAA
ATTTTTGGATTTTCGAAAAACCGAATTAAGGGGAGGCCTTTTCCAAACAAG TTTTCCTTAAACAAGAAAAAAAATTTGGGGGTTGAAAAAGATTTAAAACC ATTGGGGTTTAGGCCCTAAAAAAAGCCCACCTGGGAATTTTGGGGGCTTTT TTTAAGGGCCTCAGCAGCCGCCCCTGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGG GGGGGGTATGGTTGCAAGGGTGAAAATTAAAGGAAATGGCGGAAGGGCC CCCCCCGGGGGGGGGCCCGCGGGTTAATTTGACTCAACCCGGGAAAAATT TCCCGGTCCCGACAAAGGGAGGATTGACAGATTGAGGGGTTTTTCAAGGTT TTATGGGGGGGGGGGCATGGCCGTTTTTAGGTGGGGGGGGGAATTGTTTG GGTAATTCCGTTAAAGAAAGGGACCTCGGCCTACTAAAAAGGGGGGGGGA AGGCAACAAAGGACGTTTTTAACTTTTTAAAGGGACATGTCCGGTTTACGG GCAGGAAGTTGGAGGCAATAACAGGTTGGGGATGCCCTTAAAGGTTTTGG GCCCCCCCCCCGCTCCACTAAGGGGTTCATCGGGTTTAAATTCAATATTTA TGGATATTGAGTGCTTCTAGGAATGG
Khi so sánh trình tự gen dòng B3 với ngân hàng GenBank trên NCBI đã cho thấy được dòng B3 có sự đồng hình với Schizochytrium sp. SKA10 với 79%.
Hình 18. Kết quả BLAST từ NCBI của dòng B3
- Dòng 14: AGTAGTTGAATTATCTTANGCACTGGGTCGACCGGTGCTTTCCTATGA ATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTTTCTTTTCTTTATTGG GGAGAAATCTTTCACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATG ACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGT TGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTA TTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGC GAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGG ATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACT TGCGATTGTTGGGTGCTTTTTTATGGGCCCCACCACCACCCCACGAGAAAA
CTAAATCTTTTGGGTCCCGGGGGGGAATGGGCCCAAGGGGGAAACTCTAA GGAAATTAGGGAAAGGGACCCCCCGGGGTGGGGCCCGCGGGTTTATTTTA CTCTCAACGGGAAAACTTTCCCCGGGCCCACACATGGGGGGTTTTCACATT TAGAGCTCTCTCTCGAGACTATGGGGGGGGGGGCGCGGGGCCTCTCATTTT GGGTAGAGATATGTGTGGGGAATTCCCTGTACGCACGAGACCCCGCGCTCT CCTAAATGGCGTGTGGTGGGCCCATATAAAGCTTTTACGCTTTAAAACGGG CATTTTGCGTGTATCGGGGCGGAAATCTAGGGAAATACAGTCCTGTGAAGC CACTCAAAGATTATGGGCGCANCGCCGCATCAGATGGCGCTGTCGAGGGT GTATAATCTGTTTCTATGCATATNAGAGATATACAGAAGGTCTTGGAGAAG CTCGTGTAA
Khi so sánh trình tự gen dòng D14 với ngân hàng GenBank trên NCBI đã cho thấy được dòng D14 có sự đồng hình với Thraustochytrium sp. BP3.2.2 với 93%.
Hình 19. Kết quả BLAST từ NCBI của dòng D14
- Dòng M6 TATATAATAAATANNCCTTTTCTTATTTCCCCGCTCCAATAGCAATAT GCTAAACGTTGTCTGCAGATAAAAAAGCTCGTAGTTGAAATTCTTGGCATG GGCCGACCGGTGCTTTTCCCTGAAATGGGGATTGATTTGTCTGTGTTGCCTT GGCCATTTTTTTCTTTTCTTTATTGATAAGAAATCTTTCACTGTAATCAAAG CAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATA AGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTA ATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTG GATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCAT TAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAG TCTAGACCGTAAACGATGCCGACTTGCGATTGTTGGGTGCTTTTTTTATGG GCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAG TATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAG
GAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGT CCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTATGGG TGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCC GTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACAT AGTACGTTTTAACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTT CGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTTTGGGCCGCACGCGC GCTACACTGATGGGTTCATTAGGGCAGAGTTATATTTTAGGATATTGACTG CTTCT
Khi so sánh trình tự gen dòng M6 với ngân hàng GenBank trên NCBI đã cho thấy được dòng M6 có sự đồng hình với Schizochytrium sp. KRT1 với 98%.
Hình 20. Kết quả BLAST từ NCBI của dòng M6 4.5. Xây dựng cây phả hệ:
Dựa vào trình tự của ba dòng vi tảo B3, M6 và D14, cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.0 bằng phương pháp Maximum likelihood với số bootstrap là 1.000.
Cây phả hệ của dòng B3:
Kết quả BLAST từ NCBI (Hình 18) cho thấy dòng B3 này có sự đồng hình cao nhất với dòng Schizochytrium sp. SKA10, nhưng từ cây phả hệ (Hình 21) có thể thấy rằng dòng B3 có mối quan hệ họ hàng rất gần với dòng Aurantiochytrium sp. BR- MP4-A1. Cũng như trong cây phả hệ của dòng B3 chúng ta có thể thấy được rằng 2 dòng vi tảo Schizochytrium và Aurantiochytrium có mối quan hệ mật thiết với nhau, khó có thể phân biệt rõ ràng. Theo nhiều nghiên cứu trước đây, dựa vào các đặc điểm hình thái thì 2 chi Aurantiochytrium và Schizochytrium được xếp vào cùng 1 chi là
Schizochytrium. Theo nghiên cứu của Yokoyama và Honda (2007), dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử, chi Aurantiochytrium đã được tách ra khỏi chi Schizochytrium. Mặc dù vậy, trong nghiên cứu này, dựa vào cây phả hệ, hai chi Aurantiochytrium và
Schizochytrium đều cùng thuộc về một nhóm. Như vậy, dòng B3 có thể thuộc về cả 2 nhóm Schizochytrium và Aurantiochytrium.
Cây phả hệ của dòng M6:
Tương tự như dòng B3, dòng M6 có kết quả BLAST (Hình 22) từ NCBI đồng hình cao nhất với Schizochytrium sp. KRT1, và kết quả cây phả hệ (Hình 22) cho thấy mối quan hệ thân thuộc với các dòng thuộc Aurantiochytrium và Schizochytrium. Từ đó cũng cho thấy được rằng dòng M6 có thể cũng thuộc về 2 nhóm Aurantiochytrium
và Schizochytrium.
Cây phả hệ của dòng D14:
Dựa vào cây phả hệ (Hình 23) cũng như kết quả BLAST (Hình 19) từ NCBI có thể thấy được rằng dòng D14 có thuộc chi Thraustochytrium.
Cây phả hệ chung cho 3 dòng vi tảo B3, M6 và D14:
Dựa vào cây phả hệ có thể thấy được rằng 3 dòng vi tảo B3, M6 và D14 có mối quan hệ gần gũi với nhau, ba dòng vi tảo này đều được phân lập ở các vùng biển thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long. Đặc biệt, 2 dòng vi tảo B3 và M6 có mối quan hệ gần gũi hơn so với dòng D14. Cây phả hệ cũng cho thấy dòng B3 và M6 thuộc 2 dòng vi tảo
Auratiochytrium và Schizochytrium, trong khi dòng D14 thuộc nhóm
Thraustochytrium. Điều này cũng phù hợp với kết quả nhận diện của các cặp mồi trong nghiên cứu này. Từ đó cho thấy các cặp mồi chuyên biệt được thiết kế trong nghiên cứu này có thể được sử dụng để nhận diện nhanh vi tảo cho hiệu quả cao. Cũng từ cây phả hệ cho thấy 3 dòng vi tảo B3, M6 và D14 có khoảng cách di truyền xa so với 2 loài vi tảo Thraustochytrium striatum và Thraustochytrium aureum. Điều này cũng phù hợp với kết quả nhận diện của hai cặp mồi chuyên biệt cho hai loài vi tảo này.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Trong số 9 dòng vi tảo nghiên cứu, bằng kết quả nhận diện của các cặp mồi được thiết kế cho thấy tất cả 9 dòng đều thuộc nhóm Thraustochytrium và Schizochytrum, trong đó có 2 dòng thuộc Thraustochytrium (dòng D14 và M19) và 7 dòng thuộc
Schizochytrium (B1, B3, M3, M6, M7, M8 và M10).
5.2. Đề nghị
Hai cặp mồi chung để nhận diện Thraustochytrium và Schizochytrium, và cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium cần được nghiên cứu sâu hơn trên nhiều dòng vi tảo thuộc thraustochytrid.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Anh
Aki, T., K. Hachida, M. Yoshinaga, Y. Katai, T. Yamasaki, S. Kawamoto, T. Kakizono, T. Maoka, S. Shigeta, O. Suzuki and K. Ono. 2003. Thraustochytrid as a potential source of carotenoids. J. Am. Oil Chem. Soc, 80:789-794
Arafiles, K.H.V., J.C.O. Alcantara, J.A.L. Batoon, F.S. Galura, P.R.F. Cordero, E.M. Leaño and G.R. Dedeles. 2011. Cultural optimization of Thraustochytrids for biomass and fatty acid production. Mycosphere, 2(5):521–531.
Bongiorni, L., R. Jain, S. Raghukumar and R.K. Aggarwal. 2005. Thraustochytrium gaertnerium sp. nov.: a New Thraustochytrid Stramenopilan Protist from Mangroves of Goa, India. Protist, vol.156, pp.303-315.
Bremer, G.B. 1976. The ecology of marine lower fungi. Recent Advances in Aquatic Mycology. Elek Sclence. London, pp.313-331.
Bremer, G.B. 1995. Lower marine fungi (Labyrinthulomycetes) and the decay of mangrove leaf litter. Hydrobiologia, 295: 89-95
Bremer, G.B. and G. Talbot. 1995. Cellulolytic enzyme activity in the marine protist SchizochyMum aggregatum. Bot Mar., 38: 37-41
Burja, A.M., H. Radianingtyas, A. Windust and C.J. Barrow. 2006. Isolation and characterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytrium species: screening of strains and optimization of omega-3 production. Appl Microbiol Biotechnol, 72(6):1161-1169.
Burja, A.M., R.E. Armenta, H. Radianingtyas and C.J. Barrow. 2007. Evaluation of Fatty Acid Extraction Methods for Thraustochytrium sp. ONC-T18. J. Agric. Food Chem., 55, pp.4795−4801.
Carvalho, A.P., L.A. Meireles and F.X. Malcata, 2006. Microalgal reactors: a review of enclosed system designs and performances. Biotechnol. Prog, 22: 1490-1506.
Cavalier-Smith, T., M.T.E.P. Allsopp and E.E. Chao. 1994. Thraustochytrids are chromists, not fungi: 18S rDNA signatures of heterokonia. Philos Trans R Soc Lond Ser B Biol Sci, 346:387-397.
Chatdumrong, W., W. Yongmanitchai, S. Limtong and W. Worawattanamateekul. 2007. Optimization of docosahexaenoic acid (DHA) production and
improvement of astaxanthin content in a Schizochytrium limacinum isolated from mangrove forest in Thailand. Kasetsart Journal (Nat. Schi.), 41: 324-334. Coleman, N.Y. and J.R. Vestal. 1987. An epifluorescent microscopy study of
enzymatic hydrolysis of fluorescein diacetate associated with the ectoplasmic net elements of the protist Thraustochytrium striatum. Can J Microbiol, 33:841-843 Colorado State University. n.d. Agarose Gel Electrophoresis of DNA. Retrieved June
13, 2014, from http://www.arbl.cvmbs.colostate.edu.
Colorado State University. n.d. Principles of Gel Electrophoresis. Retrieved June 12, 2014, from http://www.arbl.cvmbs.colostate.edu.
Croome, R.L. and P.A. Tyler. 1985. Distribution of silica-scaled Chrysophyceae (Paraphysomonadaceae and Mallomonadaceae) in Australian inland waters.
Australian Journal of Marine and Freshwater Research, 36(6): 839-853.
Fell J.W. and S.Y. Newell. 1998. Molecular approaches to the study of the ocean, Chapter 12. Chapman & Hall Publishers, London, pp.262-263.
Fitch Haumann, B. 1999. Alternative sources for n-3 fatty acids. INFORM, 9:1108– 1119
Gandhi, S.R., and Weete, J.D. 1991. Production of the polyunsaturated fatty acids arachidonic acid and eicosapentaenoic acid by the fungus Pythium ultimum. J Gen Microbiol, 137:1825–1830
Giuseppe, C.Z. and M.L. Gijsbert, 2005. Molecular phylogeny of the genus Tribonema
(Xanthophyceae) using rbcL gene sequence data: monophyly of morphologically simple algal species. Phycologia, 44(4):384-392.
Gordon, D.A. and S.J. Giovannoni, 1996. Detection of stratified microbial populations related to Chlorobium and Fibrobacter species in the Atlantic and Pacific Oceans. Appl Environ Microbiol, 62:1171-1177.
Hall, B.G. 2008. Phylogenetic Trees Made Easy: A How-to Manual 3rd Ed. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, pp. 60-160.
Hall, B.G. 2013. Building Phylogenetic Trees from Molecular Data with MEGA. Mol Biol Evol., 30(5): 1229-1235
Hibberd, D.J. and G.F. Leedale, 1971. A new algal class - The Eustigmatophycaee.
Honda, D., T. Yokochi, T. Nakahara, S. Raghukumar, A. Nakagiri, K. Schumann and T. Higashihara. 1999. Molecular phylogeny of Labyrinthulids and Thraustochytrids based on the sequencing of 18S ribosomal RNA gene. J. Eukaryot. Microbiol, 46(6):637-647.
Jostensen, J.P., and Landfald, B. 1997. High prevalence of polyunsaturated fatty acid– producing bacteria in arctic invertebrates. FEMS Microbiol Lett, 151:95–101. Kinsella, J.E. 1987. Seafoods and Fish Oils in Human Health and Disease. New York:
Marcel Decker.
Krienitz, L., B. Christina, K. Kotut and L. Wei. 2012. Picocystis salinarum
(Chlorophyta) in saline lakes and hot springs of East Africa. Phycologia
51(1):22-32.
Lewis T. E., P. D. Nichol and T. A. McMeekin. 1999. The biotechnological potential of thraustochytrids. Mar Biotechnol, 1:580-587.
Lewis, T.E., Mooney, B.D., McMeekin, T.A., and Nichols, P.D. 1998a. New Australian microbial sources of polyunsaturated fatty acids. Chem Aust, 65:37– 39.
Lewis, T.E., Nichols, P.D., Hart, P.R., Nichols, D.S., and McMeekin, T.A. 1998b. Enrichment of rotifers (Brachionus plicatilis) with eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid produced by bacteria. J World Aquacult Soc, 29:313–318 Lombardi, A.T. and A.A.H. Vieira, 1998. Copper and lead complexation by high
molecular weight compounds produced by Synura sp. (Chrysophyceae).
Phycologia, 37(1):34-39.
Marie, A.R.T. and M.O. Larrance, 1976. Influence of pesticides on Chlorella,
Chlorococcum, Stigeoclonium (Chlorophyceae), Tribonema, Vaucheria
(Xanthophyceae) and Oscillatoria (Cyanophyceae). Phycologia 15(1):25-36. Michael, J.W. and S. Loiseaux, 1976. Recent advances in life history studies of the