2.4.1. Nguyên lý
Điện di là một kỹ thuật được sử dụng để tách biệt và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử (đặc biệt là protein và acid nucleic) khác nhau về kích thước, điện tích hoặc
cấu trúc. Chính vì thế, nó là một trong những kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong sinh hóa và sinh học phân tử. Khi các phân tử mang điện được đặt vào điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực âm hoặc cực dương tùy thuộc vào điện tích của chúng. Khác với protein, cái mà có thể mang lưới điện tích âm hoặc lưới điện tích dương, acid nucleic chỉ mang điện tích âm do các gốc phosphate, và vì thế chúng hướng về phía cực dương (Colorado State University. n.d.).
Protein và acid nucleic được điện di trong dung dịch hoặc là trong gel. Thông thường, gel được sử dụng thành một miếng dày, với nhiều giếng để chứa mẫu. Gel sau khi đã được bỏ mẫu vào sẽ được ngâm trong dung dịch đệm điện di để cung cấp các ion tạo dòng điện và một số loại dung dịch đệm có thể được dùng để duy trì pH ở giá trị thích hợp.
Hai loại gel thường được sử dụng là gel agarose và gel polyacrylamide.
Agarose là một loại đường đa được chiết từ tảo biển. Nó thường được dùng với nồng độ từ 0,5 đến 2%. Nồng độ agarose cao giúp cho gel cứng hơn. Gel agarose dễ sử dụng, chỉ cần pha bột agarose với dung dịch đệm, nấu chảy và đổ vào khuôn. Nó cũng không gây độc hại cho cơ thể. Gel agarose có vùng phân tích rộng, nhưng lại có mức độ phân tích thấp. Bằng cách thay đổi các nồng độ agarose, chúng ta có thể tách được các đoạn DNA từ 200 đến 50.000 cặp nucleotide bằng kỹ thuật điện di chuẩn. (Colorado State University. n.d.)
Polyacrylamide là những polymer của acrylamide liên kết với nhau. Chiều dài của mạch polymer phù thuộc vào nồng độ acrylamide đã dùng, thường trong khoảng 3,5 đến 20%. Gel polyacrylamide rất khó để chuẩn bị so với gel agarose. Chúng phải được đổ trong đĩa thủy tinh vì khí oxi trong không khí có thể ức chế quá trình polymer hóa. Acrylamide là chất gây hại cho thần kinh nên cần phải được sử dụng cẩn thận. Nên sử dụng găng tay một lần khi thao tác với dung dịch acrylamide, và sử dụng khẩu trang khi cân bột. Polyacrylamide không độc, nhưng khi đổ gel polyacrylamide nên sử dụng găng tay vì có thể có những phân tử acrylamide tự do. Gel polyacrylamide có vùng phân tích nhỏ, nhưng lại có khả năng phân tích cao. Đối với DNA, polyacrylamide được sử dụng để phân tích những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 500 cặp nucleotide. Khác với agarose, polyacrylamide thường được dùng để phân tích hỗn hợp protein (Colorado State University. n.d.).
2.4.2. Các thiết bị và thành phần cần thiết cho điện di
- Bể điện di và nguồn điện
- Khuôn đổ gel: có kích thước đa dạng và có một miếng nhựa cho phép UV truyền qua.
- Thanh lược: được sử dụng trong lúc đổ gel để tạo ra các giếng
- Dung dịch điện di: Tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc Tris-borate-EDTA (TBE). - Dung dịch đệm load mẫu: có thành phần đặc (ví dụ như glycerol) giúp mẫu được giữ ở đáy giếng, và một hay hai loại thuốc nhuộm di chuyển được trong gel cho phép quan sát được bằng mắt thường để xác định thời điểm thích hợp để kết thúc điện di.
- Ethidium bromide: thuốc nhuộm huỳnh quang để nhuộm acid nucleic. Chất này được coi là một tác nhân đột biến nên cần phải cẩn thận trong khi thao tác.
- Máy chụp hình gel: được sử dụng để chụp hình gel đã được nhuộm bằng ethidium bromide.
2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di
- Nồng độ agarose: Những nồng độ agarose khác nhau giúp phân tích những đoạn DNA với các kích thước khác nhau. Nồng độ cao hỗ trợ phân tích những đoạn nhỏ, trong khi những đoạn DNA lớn cần dùng nồng độ thấp
Bảng 1. Các thông số điện di DNA bằng gel agarose
Hàm lượng agarose (%) trong gel Kích thước DNA mạch thằng (kb) sử dụng có hiệu quả 0,3 60 – 5 0,6 20 – 1 0,7 10 – 0,8 0,9 7 – 0,5 1,2 6 – 0,4 1,5 4 – 0,2 2,0 3 – 0,1 (Nguồn: Mạc Văn Trọng, 2013)
- Điện thế: điện thế càng cao thì, tốc độ di chuyển của những đoạn DNA lớn sẽ tăng lên nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. Với những đoạn lớn hơn 2000 nu, điện thế
được sử dụng thường không quá 5V/cm đối với gel (cm là giá trị khoảng cách giữa 2 điện cực, không phải chiều dài gel) (Colorado State University. n.d.).
- Dung dịch điện di: đối với điện di DNA, 2 loại thường được sử dụng là TAE và TBE. Vận tốc di chuyển của DNA sẽ khác nhau đối với từng loại dung dịch bởi sự khác biệt về thành phần ion. Dung dịch điện di không những ổn định pH mà còn cung cấp ion giúp hỗ trợ tính dẫn điện (Colorado State University. n.d.).
- Ethidium Bromide: thường được dùng để nhuộm DNA giúp quan sát DNA dễ dàng hơn dưới tia UV. °C
2.5. Thiết kế mồi
2.5.1. Những điều cần chú ý trong thiết kế mồi
- Chiều dài đoạn mồi: độ dài tối ưu của một đoạn mồi PCR là 18 – 22 nu. Độ dài này đủ dài để đoạn mồi có tính chuyên biệt cao, đủ ngắn để mồi có thể bám vào khuôn mẫu DNA một cách dễ dàng ở nhiệt độ hồi tính
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm): là nhiệt độ mà tại đó một nửa DNA mạch kép bị biến tính và tách ra thành 2 mạch đơn. Đoạn mồi với nhiệt độ từ 52 – 58°C là tối ưu. Nếu nhiệt độ nóng chảy quá cao trên 65C thì mồi sẽ có xu hướng hồi tính thứ cấp. Phần trăm GC của trình tự mồi quyết định Tm của đoạn mồi. Nhiệt độ nóng chảy của cả 2 mồi xuôi và ngược không được chênh lệch quá 5°C.
- Nhiệt độ hồi tính (Ta): nhiệt độ nóng chảy quyết định đến tính ổn định của mạch ghép DNA-DNA và cũng là cơ sở để xác định nhiệt độ hồi tính. Nếu nhiệt độ hồi tính quá cao sẽ làm giảm hiệu suất của sản phẩm khuôn DNA-đoạn mồi. Nếu nhiệt độ quá thấp thì sản phẩm sẽ không chuyên biệt gây ra bởi hiện tượng bắt cặp sai.
Công thức tính nhiệt độ hồi tính:
Ta = 0,3 x Tm(mồi) + 0,7 Tm (sản phẩm) – 14,9 - Phần trăm GC: phần trăm GC thường trong khoảng 40-60%
- Dấu GC: sự có mặt của G và C ở vị trí 5 nucleotide cuối đầu 3’ của mồi giúp hỗ trợ cho việc bám dính chuyên biệt ở đầu 3’ do liên kết mạnh của G và C. Nên tránh nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C ở 5 vị trí cuối ở đầu 3’ của mồi
- Cấu trúc bậc 2 của mồi: sự xuất hiện của cấu trúc bậc 2 do các tương tác nội và ngoại phân tử có thể dẫn đễn hiệu suất PCR giảm. Chúng ảnh hưởng đến việc gắn mồi vào khuôn mẫu và vì vậy cản trở việc khuyếch đại DNA.
+ Cấu trúc hairpin: Được tạo thành bằng tương tác nội phân tử trong đoạn mồi.
+ Tự bắt cặp 2 đoạn mồi (Seft Dimer): được tạo thành bằng tương tác ngoại phân tử giữa 2 đoạn mồi ở vị trí tương đồng của 2 đoạn mồi cùng loại. Thực tế, lượng mồi dùng trong PCR nhiều hơn so với lượng DNA.
+ Bắt cặp chéo (Cross Dimer): tạo thành bởi tương tác ngoại phân tử của 2 đoạn mồi khác loại.
- Lặp đoạn: đoạn lặp là 1 bộ gồm 2 nucleotide xuất hiện nhiều lần trong trình tự, nên tránh các đoạn lặp trong trình tự của đoạn mồi. Ví dụ: ATATATAT… Số lần lặp tối đa có thể chấp nhận được là 2 lần lặp
- Lặp nucleotide: các đoạn mồi với một đoạn dài chỉ chứa một nucleotide nên bị hạn chế vì nó sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai của đoạn mồi. Tối đa chỉ khoảng 4 nucleotide
được lặp liên tiếp (https://dnacore.mgh.harvard.edu/cgi-bin/sequencing
/PCR_Primer_Design_Guidelines.htm, ngày 14/06/2014).
2.5.2. Các phần mềm thiết kế mồi
Có nhiều công cụ hỗ trợ cho việc thiết kế đoạn mồi cho phản ứng PCR. Những công cụ này giúp giảm chi phí và thời gian thí nghiệm. Chẳng hạn như Primer Premier tuân thủ tất cả các tiêu chuẩn thích hợp cho việc thiết kế mồi của phản ứng PCR. Những phần mềm như AlleleID và Beacon Designer cũng có thể thiết kế các đoạn mồi và những đoạn dò cho những khảo nghiệm phức tạp. PrimerPlex là một phần mềm dùng để thiết kế mồi ASPE (http://www.premierbiosoft.com/tech_notes /PCR_Primer_Design.html, ngày 14/06/2014). Ngoài ra còn có những trang web cung cấp những công cụ thiết kế mồi trực tuyến như NCBI.
2.5.2.1 Primer Premier
Primer Premier là một phần mềm toàn diện trong thiết kế và phân tích mồi PCR. Thuật toán tìm kiếm của phần mềm này có thể tìm thấy đoạn mồi thích hợp với nhiệt
độ nóng chảy rất chính xác bằng cách sử dụng thuật toán nhiệt động học lân cận gần nhất. Đoạn mồi có thể được kiểm tra về những tính chất như cấu trúc bậc 2, cấu trúc dimer, cấu trúc hairpin, tính tương đồng và tính chất vật lý trước khi cho ra kết quả thích hợp nhất. Ngoài ra, phần mềm này có thể được sử dụng để thiết kế mồi cho xác
định kiểu gen SNP, khảo nghiệm với nhiều loại mồi
(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html, ngày 14/06/2014).
2.5.2.2. Beacon Designer
Phần mềm này có thể dùng để thiết kế mồi cho real time PCR và các mẫu dò. Nó được sử dụng rộng rãi trên thế giới bởi các nhà sinh học phân tử để thiết kế mồi cho khảo nghiệm real time PCR. Đây là một giải pháp linh hoạt cho thiết kế mồi real time và mẫu dò (http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html ngày 14/06/2014 ).
2.5.2.3. PrimerPlex
PrimerPlex là một công cụ hiệu quả và tinh vi để thiết kế các đoạn mồi cho khảo nghiệm multiplex. Khảo nghiệm multiplex hỗ trợ cho việc nhân lên của một số lượng lớn đối tượng trong 1 phản ứng, tiết kiệm thời gian và chi phí thí nghiệm
PrimerPlex thiết kế các đoạn oligo cho khảo nghiệm multiplex PCR. Phần mềm này còn có thể thiết kế các mẫu dò chuyên biệt cho khảo nghiệm lai trực tiếp và mồi cho khảo nghiệm ASPE (http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html ngày 14/06/2014).
2.5.2.4. DNAClub
So với các phần mềm khác, DNACLub tiện lợi hơn vì nó rất dễ cài đặt, dễ sử dụng và thao tác trên chương trình với những cấu trúc lệnh khá đơn giản. Theo Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh (2011), DNACLub là phần mềm cơ bản nhất trong việc lựa chọn và thiết kế mồi cho phản ứng PCR.
Tính năng: loại bỏ trình tự vector, tìm kiếm khung đọc mở, chỉnh sửa trình tự DNA, giải mã thành trình tự protein, bản đồ enzyme, cắt giới hạn, chọn lựa primer, đánh giá primer.... (http://sinhhoc.blogspot.com/2011/10/phan-mem-dnaclub.html, ngày 15/06/2014)
2.5.2.5. FastPCR
Theo Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh (2011), FastPCR là chương trình thiết kế mồi được cung cấp miễn phí với các tính năng thiết kế mồi cho PCR, PCR ngược, Real-Time PCR, PCR phức, PCR suy biến… Bên cạnh đó còn có tính năng sắp xếp trình tự chuỗi, phân tích nhóm hay tìm kiếm những trình tự lặp.
2.5.2.6. Primer3
Primer3 là chương trình được sử dụng phổ biến để thiết kế mồi (primer) cho phản ứng PCR. Đây là chương trình mã nguồn mở, do Steve Rozen và Helen Skaletsky phát triển tại Whitehead Institute và Howard Hughes Medical Institute, USA. Primer3 cũng có thể dùng để thiết kế các mẫu dò (probe) và các primer cho giải trình tự. Vì PCR được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau nên Primer3 có nhiều các thông số mà bạn có thể điều chỉnh để tạo ra những primer tốt nhất cho mục đích của bạn. (http://sinhhoc.blogspot.com/2012/07/huong-dan-su-dung-primer3-e-thiet-ke.html, ngày 15/06/2014)
2.6. Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 6.0
Phân tích phả hệ là một bộ môn nghiên cứu về mối quan hệ:
- Phương pháp phân tích dựa trên độ dài di truyền (Distance-based Method) + Phương pháp này dựa trên mức độ khác nhau về độ dài giữa 2 trình tự được sắp xếp để xây dựng cây phả hệ. Phương pháp dựa trên độ dài có thể xây dựng được cây phả hệ thật sự nếu tất cả những phân ly di truyền đều được ghi nhận chính xác trong trình tự.
+ Phương pháp UPGMA: thích hợp đối với những loài có họ hàng rất gần.
+ Phương pháp Neighbor-joining (NJ): nhanh, thích hợp khi sử dụng nguồn dữ liệu lớn (Hall, 2008).
- Phương pháp phân tích Character-base method.
+ Phương pháp này cho phép đánh giá mức độ tin cậy ở từng base bằng sự sắp xếp (alignment) ở mức độ cơ bản của tất cả các vị trí base. Có nhiều phương pháp ví dụ như: Maximum Parsimony (MP), Maximum Likelihood (ML).
+ Maximum Parsimony (MP): gặp vấn đề khi nhánh dài.
+ Maximum Likelihood (ML): thống kế hiệu quả nhưng tốc độ chậm khi dữ liệu quá lớn.
+ Bayesian Inference (BI): nhanh hơn, trước khi phân bố thước đo phải được chuyên hóa (Hall, 2008).
+ Sắp xếp mức độ chính xác của các phương pháp: BI > ML > MP > NJ.
Bảng 2. So sánh thời gian xử lý của 4 phương pháp NJ, MP, ML và BI
Dữ liệu NJ MP ML BI
Dữ liệu nhỏ 1 giấy 3 giây 6 giây -
Dữ liệu nhỏ với độ tin cậy cao
9 giây 10 phút 1 giờ 34 phút 29 phút 40 giây
Dữ liệu lớn 1 giây 22 giây 3 phút 29 giây
Dữ liệu lớn với độ tin cậy cao
86 giây 10 giờ 2 phút 58 giờ 6 giờ 33 phút
(Nguồn: Hall, 2013)
- Thiết lập độ tin cậy (bootstrap): số lần bootstrap thường trong khoảng 100- 2000, số càng lớn độ tin cậy càng cao. Chỉ số bootstrap chỉ cho thấy độ tin cậy của từng node trong cây phả hệ chứ không nêu lên độ tin cậy của tất cả các taxon của cây. Chỉ số bootstrap >70% được xem xét là đáng tin cậy (Hall, 2013).
2.7. Các nghiên cứu trước đây về các dòng vi tảo Thraustochytrid
Honda et al. (1999) đã có những nghiên cứu về trình tự 18S rDNA của một số nhóm thuộc thraustochytrid và đã xây dựng thành công hệ thống cây phát sinh loài. Những kết quả đạt được đã thúc đẩy các nghiên cứu sâu hơn về vi tảo thraustochytrid, cũng như mang lại kiến thức nền cho những nghiên cứu về phân lập thraustochytrid bằng dấu phân tử 18S rDNA.
Trong thí nghiệm của Mo et al. (2002), ba bộ mồi được thiết kế trên vùng 18S rDNA để phân loại những chủng thraustochytrid. Với 26 dòng vi tảo phân lập được kiểm tra bằng phương pháp PCR, bài nghiên cứu cho thấy rằng không phải tất cả đều giống nhau về các band PCR, chứng tỏ sự đa dạng trong nhóm vi tảo này. Từ đó, Mo đưa ra kết luận rằng dựa vào kỹ thuật PCR trong phân loại vi tảo dựa trên vùng 18S rDNA là một cung cấp hữu hiệu trong việc nghiên cứu vi tảo thraustochytrid.
Cavalier-Smith et al. (1994) đã cho thấy rằng trình tự 18S rDNA của những dòng vi tảo có sự khác biệt so với những loài sinh vật nhân thực khác ở chuỗi xoắn 47 trong vùng V9.
Theo nghiên cứu của Yang et al. (2009) trên các dòng vi tảo ở Đài Loan, những loài vi tảo dị dưỡng có khả năng cung cấp DHA như thraustochytrid có thể được phân
lập, nuôi cấy và phân loại dựa trên vùng trình tự 18S rDNA và những đặc trưng hình thái học. Kết quả đạt được là đã phân lập được 25 chủng vi tảo dụ dưỡng ở vùng biển Đài Loan. Những chủng này có họ hàng thân thiết với nhau và với họ Thraustochytriaceae dựa trên nghiên cứu trong vùng 18S rDNA.
Trong nghiên cứu của Lê Bích Tuyền (2013), 13 dòng vi tảo đã được phân lập từ các mẫu lá đước và bần ở ven biển các tình Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh. Dựa vào các kiểm tra đặc tính trên khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khảo sát PCR với mồi chuyên biệt trên vùng 18S rDNA đã xác định các dòng vi tảo này thuộc thraustochytrid. Nghiên cứu tiếp theo dựa trên giải trình tự cũng cho thấy rằng dòng D5 (dòng có sản lượng carotenoid cao nhất) có sự đồng hình 96% đối với trình tự của Thraustochytrium aurantiochytrium sp. B072. Từ đó, cho thấy rằng những giống vi tảo thraustochytrid ở vùng biển Việt Nam có họ hàng thân thuộc với những giống vi tảo đã được nghiên cứu trên thế giới.
Dương Tấn Phát (2013) đã phân lập được 9 dòng vi tảo dị dưỡng dựa trên các