Chín dòng vi tảo được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật của Viện Nghiện cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Đại học Cần Thơ.
Bảng 3. Các dòng vi tảo và nguồn gốc các dòng vi tảo đã phân lập
STT Ký hiệu Nguồn Địa điểm thu mẫu
1 B1 Lá Bần Bến Tre 2 B3 Lá Bần Bến Tre 3 M3 Lá Mắm Bến Tre 4 M6 Lá Mắm Bến Tre 5 M7 Lá Mắm Bến Tre 6 M8 Lá Mắm Bến Tre 7 M10 Lá Mắm Trà Vinh 8 M19 Lá Mắm Trà Vinh 9 D14 Lá Đước Trà Vinh 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ 3.1.3.1. Thiết bị - Tủ cấy vô trùng
- Máy khử trùng nhiệt ướt - Máy li tâm
- Cân điện tử
- Máy đo OD Backman Coulter - Máy PCR BioRAD
- Bộ điện di ngang
- Tủ mát 4-10oC (Alaska) - Tủ lạnh -20oC (Akira) - Máy ly tâm chân không
3.1.3.2 Dụng cụ
- Micropipette, đầu cone - Đèn cồn
- Ống fancol 15 ml - Chai nắp xanh.
- Tube Eppendorf 1,5 ml và 2,2 ml, tube PCR. - Khay đựng nước đá
- Ống đong, kéo
3.1.4. Hóa chất
- Cồn tuyệt đối và 70% (ethanol), cát thủy tinh.
- Hóa chất trích DNA và thực hiện phản ứng PCR như: Extraction buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8), 500 mM NaCl, 50 mM EDTA; trước khi sử dụng cho thêm 10 mM beta mercapthoethanol (7 µl beta mercapthoethanol cho 10 ml dung dịch trích EB)), TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8 và EDTA 1 mM, pH 8), Buffer, dNTPs, MgCl2 1,5 mM, Taq polymerase…
- Hóa chất thực hiện điện di: Agarose, đệm điện di TBE 1X (Tris base 10,8 g, Boric acid 5,5 g/L, EDTA 0,5 M 4 ml), Loading buffer (3 ml glycerol 30%, 20 mg bromophenol blue 0,25%, 200 mM Tris, 20 mM Na2EDTA, nước cất vừa đủ 10 ml, bảo quản 4oC), SafeView (10 mg/ml).
- Thang chuẩn 100 bp của công ty Fermentas.
3.2. Phương pháp
3.2.1. Quy trình nuôi tăng sinh khối vi tảo
Để tăng sinh khối của vi tảo giúp thu được nhiều DNA, vi tảo sẽ được nuôi tăng sinh khối với thể tích lớn hơn. Môi trường được dùng để nuôi tăng sinh là môi trường NM-5, vi tảo được cấy vào các ống fancol 15 ml đã có chứa sẵn môi trường. Sau đó, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong 4 ngày.
Bảng 4. Thành phần môi trường NM-5 Thành phần Nồng độ D – Glucose 50 g/l Yeast extract 10 g/l Peptone 10 g/l NaCl 1 g/l MgSO4 10 g/l
Nước cất Thêm cho đủ 1 lít
Streptomycin (Strep) 300 mg/l
Ampicillin (Amp) 200 mg/l
(Nguồn: Trần Thị Xuân Mai et al., 2014)
3.2.2. Quy trình trích DNA vi tảo bằng CTAB
Quy trình trích dựa theo quy trình trích CTAB của Roger và Bendich (1988) có chỉnh sửa và bổ sung.
- Quy trình căn bản được dựa theo quy trình trích DNA bằng CTAB của Rogers và Bendich (1994) nhưng có thêm một số bước thay đổi: Dung dịch vi tảo (10ml) được nuôi cấp I và được thu sinh khối bằng cách ly tâm ở vận tốc 5.000 vòng/ phút trong 10 phút. Chuyển phần tủa vào trong một cối bằng sứ, cho một lượng tương đương cát thủy tinh đã khử trùng vào cối, thêm 4 ml dịch trích (100 mM Tris-HCl (pH8), 500 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM beta mercaptho ethanol), dùng chày nghiền kỹ. Chuyển 2 ml dung dịch vi tảo vào tube eppendorf mới. Thêm 100 µl SDS 10% vào tuýp. Trộn đều, tránh lắc mạnh. Ủ ở 65°C trong 30 phút, khoảng 5 phút đảo nhẹ tuýp để trộn mẫu. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần trong vào tuýp mới, thêm một lượng tương đương isopropanol, ủ 20 phút trên khay nước đá. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ phần dung dịch, hòa tan tủa DNA với 500 µl TE 1X. Thêm 500 µl dung dịch đệm CTAB và ủ ở 65°C trong 15 phút. Thỉnh thoảng đảo tuýp để trộn đều mẫu. Thêm 1 ml Chloroform: Isoamylalcohol và trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần dung dịch trong qua tuýp mới. Thêm 1 ml Ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, đổ bỏ phần dung dịch và rửa phần tủa với 500 µl Ethanol 70%. Thực hiện thao tác rửa 2 lần. Loại bỏ dung dịch Ethanol 70%. Sấy khô DNA với máy ly tâm chân không ở 45°C trong 30 phút. Hòa tan DNA với 100 µl nước cất vô trùng, trữ ở -20°C.
3.2.3. Phản ứng PCR
Việc nhận diện dòng vi tảo Thraustochytrid được tiến hành bằng kỹ thuật PCR đơn mồi.
Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 µl/tube.
Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần: 75 mM Tris HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4; 0,1% Triton X-100; 0,5% DMSO, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mỗi loại, 200 nM mỗi loại mồi, 1,25 unit Taq polymerase, 1,5 µl PVP và 50-100 ng DNA. Thêm nước cất vô trùng cho đủ thể tích 25µl. Sau khi có kết quả thiết kế các cặp mồi, chu kỳ nhiệt PCR được tính toán tối ưu để phù hợp với nhiệt độ nóng chảy Tm của các cặp mồi.
Cho các tube PCR vào máy PCR Bio-Rad DNA và thiết lập chu kỳ nhiệt phản ứng trên máy.
Bảng 5. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi1
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 54 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 6. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi2
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 4 phút 1 2 94 54 72 45 giây 45 giây 2 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 7. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Schi
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 55 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 8. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus. striatum 174F và 705R
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 56 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 9. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thaus. aureum 171F và 716R
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 56 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
3.2.4. Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose
Đối với gel nhỏ, agarose 1,5%: Chuẩn bị 20ml dung dịch đệm TBE 1X, cân 0,3g agarose cho vào chai nắp xanh. Đậy nắp cho vào lò vi sóng đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ khoảng 50-600C thì thêm vào 0,4 µl nhuộm SafeView. Lắc nhẹ và đổ vào khay điện di đã có gắn lược và để ở vị trí cân bằng. Sau khoảng 30 phút, gel đông cứng hoàn toàn, lấy nhẹ lược ra khỏi.
Chuyển gel vào trong bể điện di có chứa TBE.
Nhỏ loading buffer thành những giọt nhỏ (khoảng 2µl) trên giấy parafin. Trộn 10 µl DNA mẫu với loading buffer, sau đó nhỏ (load) vào từng giếng. Tương tự như vậy với đối chứng âm, đối chứng dương vào thang chuẩn.
Thực hiện điện di ở 100V cho đến khi vạch màu của loading buffer được khoảng 2/3 gel thì lấy gel ra khỏi bể điện di.
Chụp hình gel bằng máy Biorad UV 2000, ghi nhận kết quả. Các sản phẩm PCR được xác định bằng cách so với các vạch của đối chứng dương và vạch của thang chuẩn.
3.2.5. Phân tích các trình tự bằng phương pháp xây dựng cây phả hệ
Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose sẽ được tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch của Promega (Mỹ) và được giải trình tự cả hai hướng 5’ và 3’ bằng máy giải trình tự DNA tự động ABI 3130 (Mỹ). Các kết quả giải trình tự gen 18S rDNA được so sánh với các trình tự nucleotid đã được công bố từ dữ liệu trong ngân hàng gen (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) bằng cách tìm kiếm các trình tự nucleotid đồng hình qua sử dụng chương trình nucleotid BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Sử dụng các trình tự đã công bố để so sánh vùng tương đồng bởi clustalW, từ đó cây phả hệ được xây dựng với phần mềm MEGA version 6.0 sử dụng bootstrap phân tích các mẫu với 1.000 lần.
3.3. Bố trí thí nghiệm
3.3.1. Thiết kế các đoạn mồi PCR
Mục đích: thiết kế được cặp mồi chuyên biệt cho các dòng vi tảo Thraustochytrid Thực hiện: các trình tự đoạn gen 18S rDNA của các vi tảo thuộc các dòng Thraustochytrid được lấy từ ngân hàng gen của NCBI. Các cặp mồi chuyên biệt được thiết kế dựa trên các trình tự 18S rDNA của các dòng vi tảo mục tiêu bằng phần mềm DNAMAN 4.0. Sau đó được đặt hàng và sử dụng trong phản ứng PCR.
3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi
Mục đích: đánh giá tính chuyên biệt của các cặp mồi đã thiết kế dùng để xác định vi tảo Thraustochytrid bằng kỹ thuật PCR.
Thực hiện: sau khi trích DNA các chủng vi tảo phân lập được của phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật, tiến hành thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi
chuyên biệt sẵn có và cặp mồi tự thiết kế nhằm xác định độ đặc hiệu của cặp mồi thiết kế.
Chu trình nhiệt phản ứng sẽ được điều chỉnh sao cho phù hợp với cặp mồi sử dụng. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose nồng độ thích hợp trong đệm điện di TBE 1X.
3.3.3. Thực hiện giải trình tự các dòng vi tảo phân lập:
Mục đích: kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế
Thực hiện: chọn ra 2-3 dòng vi tảo để xác định trình tự nhằm đánh giá tính chuyên biệt của các mồi. Sản phẩm PCR bằng cặp mồi chung Thraus-Schi2 sẽ được giải trình tự bằng máy giải trình tự ABI3130 của phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Cần Thơ.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quan sát các dòng vi tảo dưới kính hiển vi:
Hình 3. Kết quả quan sát 9 dòng vi tảo dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000X) A: Dòng B1 B: Dòng B3 C: Dòng M6 D: Dòng M3 E: Dòng M7 F: Dòng M8 G: Dòng M19 H: Dòng M10 I: Dòng D14 A B C D E F G H I
Bảng 10. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập
Dòng vi tảo
Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch NM-5
Đặc điểm hình thái tế bào vi tảo
B1 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt trơn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng sữa.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-8 µm, sống riêng lẻ.
B3 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt bóng ướt, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu trắng đục, khi già chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 20 µm, sống tập đoàn.
M3 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt khô, khuẩn lạc có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 8 - 12 µm, sống thành tập đoàn.
M6 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt nhẵn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng đục sau đó chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5-12 µm, sống riêng lẻ.
M7 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt nhẵn, khô, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu hồng nhạt, khi già có màu hồng đậm hơn.
Hình bầu dục, đường kính khoảng 3-7 µm, đơn bào, sống tập đoàn.
M8 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt bóng, ướt, khuẩn lạc có màu hồng nhạt sau đó chuyển sang màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 3 - 8 µm, sống tập đoàn
M10 Khuẩn lạc hình thành sau 3-4 ngày, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 15 – 20 µm, sống tập đoàn.
M19 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu vàng nhạt, khi già có màu vàng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 2-14 µm, sống riêng lẻ.
D14 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt khô, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng nhạt.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-6 µm, sống tập đoàn
Dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào theo như mô tả của Arafiles et al. (2011), chín dòng vi tảo đã được nhận diện bước đầu là vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrid. Tuy nhiên cho đến nay nhóm Thraustochytrid đã có ít nhất là 6 chi bao gồm: Thraustochytrium, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium và Ulkenia. Theo cách phân loại truyền thống của chúng chủ yếu dựa trên các giai đoạn phát triển vòng đời, sự hiện diện của các bào tử động (zoospore), kích thước tế bào...dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần (Hình 3) đã
cho thấy 9 dòng vi tảo này có hinh dạng tế bào khá giống nhau, phần lớn các dòng có hình dạng của tế bào là hình cầu, bên trong tế bào có chứa rất nhiều thể lipid. Bên cạnh đó dựa vào hình dạng khuẩn lạc tế bào (Bảng 10) cũng cho thấy hầu hết các khuẩn lạc từ các 9 dòng vi tảo này có những mô tả khá giống nhau. Do đó rất khó nhận diện các dòng vi tảo này thuộc chi nào nếu chỉ dựa vào hình thái khuẩn lạc hay hình dạng tế bào.
4.2. Kết quả thiết kế mồi
4.2.1. Hai cặp mồi chung Thraustochytrium và Schizochytrium
Dựa vào các nghiên cứu trong và ngoài nước đã công bố cho thấy phần lớn các dòng vi tảo được phân lập từ các vùng biển thuộc khu vực Châu Á đều thuộc chi
Thraustochytrium và Schizochytrium. Do đó cặp mồi chung được thiết kế dựa trên trình tự gen mã hóa 18S rDNA của các loài vi tảo mục tiêu bao gồm:
Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium aureum,
Thraustochytrium aggregatum, Schizochytrium minutum, Schizochytrium limacinum
và Schizochytrium aggregatum. Các trình tự này được lấy từ Ngân Hàng Gen của NCBI với các số đăng ký lần lượt là L34668, AB022113, AB022112, AB022111, AB022110, AB022109, AB022108, AB022107, AB022106. Ngoài ra các trình tự của các loài Labyrinthula sp. AN-1565 (AB022105), Labyrinthuloides minuta (L27634),
Ulkenia profunda (L34054), Ulkenia profunda no.29 (AB022114), Ulkenia radiata
(AB022115), Ulkenia visurgensis (AB022116) cũng được sử dụng như là các dòng đối chứng. Các dòng vi tảo mục tiêu được sử dụng trong nghiên cứu này là những đại diện đặc trưng cho các chi và được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu về thiết kế mồi nhận diện thraustochytrid dựa trên vùng gen 18S rDNA. Trong nghiên cứu của Mo et al. (2002), đã dựa trên vùng trình tự 18S rDNA của những dòng phổ biến (thuộc các chi Thraustochytrium, Schizochytrium, Ulkenia và Labyrinthuloides) để thiết kế ba cặp mồi để phân loại các chủng thraustochytrid. Bên cạnh đó, trong báo cáo của Dương Tấn Phát (2013), các dòng vi tảo Thraustochytrium pachydermum,
Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium aggregatum và Schizochytrium aggregatum cũng được sử dụng để thiết kế cặp mồi chung nhận biết nhóm vi tảo thraustochytrid.
Khi so sánh trình tự các dòng Thraustochytrium và Schizochytrium với các dòng vi tảo họ hàng là Ulkenia và Labyrinthula, kết quả tìm được là 3 trình tự mồi có sự đồng hình cao giữa 2 dòng Thraustochytrium và Schizotrium nhưng lại có sự khác biệt so với 2 dòng Ulkenia và Labyrinthula. Vị trí của 3 vùng trình tự: Vùng 1 (Hình 4), vùng 2 (Hình 5) và vùng 3 (Hình 6). Dựa vào 3 vùng trình tự này, hai cặp mồi để nhận diện Thraustochytrium và Schizochytrium được thiết kế như sau:
Vùng 1 và vùng 2 tạo thành cặp mồi thứ nhất với kích thước band khoảng 500bp 18S Thraus-Schi1 F: 5’ GCG AAT GGC TCA TTA TAT C 3’
18S Thraus-Schi1 R: 5’ TGC TAT TGG AGC TGG AAT 3’
Vùng 2 và vùng 3 tạo thành cặp mồi thứ hai với kích thước band khoảng 1000bp
18S Thraus-Schi2 F: 5’ ATT CCA GCT CCA ATA GCA 3’
18S Thraus-Schi2 R: 5’ AAA TCT ATC CCC ATC ACG 3’
Hình 4. Vùng đồng hình thứ nhất giữa các dòng Thraustochytrium và
Schizochytrium
Hình 5. Vùng đồng hình thứ hai giữa các dòng Thraustochytrium và
Hình 6. Vùng đồng hình thứ ba giữa các dòng Thraustochytrium và
Schizochytrium
4.2.2. Cặp mồi nhận biết dòng Schizochytrium:
Cặp mồi nhận biết dòng Schizochytrium được thiết kế dựa trên vùng đồng hình