Hình 2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Giai đoạn khởi đầu: làm nóng nhiệt độ khoảng 94-96°C, và giữ từ 1 đến 9 phút. Giai đoạn này chỉ dành cho DNA polymerase cần nhiệt hoạt hóa.
Giai đoạn biến tính: Đây là giai đoạn đầu tiên trong chu trình, gia nhiệt từ 94- 980C trong 20 đến 30 giây. Chính nhiệt độ cao tạo nên sự thay đổi trong mạch khuôn DNA bằng cách bẻ gãy liên kết Hydro giữa các base bổ sung. Kết quả của giai đoạn này là tạo thành các phân tử DNA mạch đơn.
Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ giảm xuống còn 50-65°C trong 20 đến 40 giây cho phép các đoạn mồi gắn vào DNA mạch đơn được dùng làm khuôn mẫu. Nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn Tm của đoạn mồi được dùng từ 3 đến 5°C. Liên kết hydro DNA- DNA chỉ tạo thành khi trình tự đoạn mồi rất trùng khớp với trình tự mạch khuôn. Sau đó, enzyme DNA polymerase bám vào và bắt đầu hình thành DNA mới.
Giai đoạn kéo dài: Đây là giai đoạn cuối cùng của một chu trình PCR, nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase được dùng. Đối với Taq polymerase thì nhiệt độ tối ưu nhất là khoảng 75 đến 80°C, và nhiệt độ thường dùng là 72°C. Ở giai đoạn này, DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung với mạch khuôn bằng cách thêm các dNTPs vào mạch khuôn từ đầu 5’ đến 3’. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào loại enzyme được dùng cũng như chiều dài mạch khuôn cần nhân lên.
Giai đoạn kéo dài cuối cùng: giai đoạn này diễn ra ở 70 đến 74°C trong 5 đến 15 phút sau chu trình cuối cùng của PCR để đảm bảo rằng các mạch đơn DNA đều được kéo dài.
Giai đoạn trữ: nhiệt độ từ 4 đến 15°C để trữ trong thời gian ngắn (Shafique, 2012).