Mục đích: kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế
Thực hiện: chọn ra 2-3 dòng vi tảo để xác định trình tự nhằm đánh giá tính chuyên biệt của các mồi. Sản phẩm PCR bằng cặp mồi chung Thraus-Schi2 sẽ được giải trình tự bằng máy giải trình tự ABI3130 của phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Cần Thơ.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quan sát các dòng vi tảo dưới kính hiển vi:
Hình 3. Kết quả quan sát 9 dòng vi tảo dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000X) A: Dòng B1 B: Dòng B3 C: Dòng M6 D: Dòng M3 E: Dòng M7 F: Dòng M8 G: Dòng M19 H: Dòng M10 I: Dòng D14 A B C D E F G H I
Bảng 10. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập
Dòng vi tảo
Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch NM-5
Đặc điểm hình thái tế bào vi tảo
B1 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt trơn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng sữa.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-8 µm, sống riêng lẻ.
B3 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt bóng ướt, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu trắng đục, khi già chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 20 µm, sống tập đoàn.
M3 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt khô, khuẩn lạc có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 8 - 12 µm, sống thành tập đoàn.
M6 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt nhẵn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng đục sau đó chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5-12 µm, sống riêng lẻ.
M7 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt nhẵn, khô, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu hồng nhạt, khi già có màu hồng đậm hơn.
Hình bầu dục, đường kính khoảng 3-7 µm, đơn bào, sống tập đoàn.
M8 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt bóng, ướt, khuẩn lạc có màu hồng nhạt sau đó chuyển sang màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 3 - 8 µm, sống tập đoàn
M10 Khuẩn lạc hình thành sau 3-4 ngày, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 15 – 20 µm, sống tập đoàn.
M19 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu vàng nhạt, khi già có màu vàng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 2-14 µm, sống riêng lẻ.
D14 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt khô, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng nhạt.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-6 µm, sống tập đoàn
Dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào theo như mô tả của Arafiles et al. (2011), chín dòng vi tảo đã được nhận diện bước đầu là vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrid. Tuy nhiên cho đến nay nhóm Thraustochytrid đã có ít nhất là 6 chi bao gồm: Thraustochytrium, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium và Ulkenia. Theo cách phân loại truyền thống của chúng chủ yếu dựa trên các giai đoạn phát triển vòng đời, sự hiện diện của các bào tử động (zoospore), kích thước tế bào...dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần (Hình 3) đã
cho thấy 9 dòng vi tảo này có hinh dạng tế bào khá giống nhau, phần lớn các dòng có hình dạng của tế bào là hình cầu, bên trong tế bào có chứa rất nhiều thể lipid. Bên cạnh đó dựa vào hình dạng khuẩn lạc tế bào (Bảng 10) cũng cho thấy hầu hết các khuẩn lạc từ các 9 dòng vi tảo này có những mô tả khá giống nhau. Do đó rất khó nhận diện các dòng vi tảo này thuộc chi nào nếu chỉ dựa vào hình thái khuẩn lạc hay hình dạng tế bào.
4.2. Kết quả thiết kế mồi
4.2.1. Hai cặp mồi chung Thraustochytrium và Schizochytrium
Dựa vào các nghiên cứu trong và ngoài nước đã công bố cho thấy phần lớn các dòng vi tảo được phân lập từ các vùng biển thuộc khu vực Châu Á đều thuộc chi
Thraustochytrium và Schizochytrium. Do đó cặp mồi chung được thiết kế dựa trên trình tự gen mã hóa 18S rDNA của các loài vi tảo mục tiêu bao gồm:
Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium aureum,
Thraustochytrium aggregatum, Schizochytrium minutum, Schizochytrium limacinum
và Schizochytrium aggregatum. Các trình tự này được lấy từ Ngân Hàng Gen của NCBI với các số đăng ký lần lượt là L34668, AB022113, AB022112, AB022111, AB022110, AB022109, AB022108, AB022107, AB022106. Ngoài ra các trình tự của các loài Labyrinthula sp. AN-1565 (AB022105), Labyrinthuloides minuta (L27634),
Ulkenia profunda (L34054), Ulkenia profunda no.29 (AB022114), Ulkenia radiata
(AB022115), Ulkenia visurgensis (AB022116) cũng được sử dụng như là các dòng đối chứng. Các dòng vi tảo mục tiêu được sử dụng trong nghiên cứu này là những đại diện đặc trưng cho các chi và được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu về thiết kế mồi nhận diện thraustochytrid dựa trên vùng gen 18S rDNA. Trong nghiên cứu của Mo et al. (2002), đã dựa trên vùng trình tự 18S rDNA của những dòng phổ biến (thuộc các chi Thraustochytrium, Schizochytrium, Ulkenia và Labyrinthuloides) để thiết kế ba cặp mồi để phân loại các chủng thraustochytrid. Bên cạnh đó, trong báo cáo của Dương Tấn Phát (2013), các dòng vi tảo Thraustochytrium pachydermum,
Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium aggregatum và Schizochytrium aggregatum cũng được sử dụng để thiết kế cặp mồi chung nhận biết nhóm vi tảo thraustochytrid.
Khi so sánh trình tự các dòng Thraustochytrium và Schizochytrium với các dòng vi tảo họ hàng là Ulkenia và Labyrinthula, kết quả tìm được là 3 trình tự mồi có sự đồng hình cao giữa 2 dòng Thraustochytrium và Schizotrium nhưng lại có sự khác biệt so với 2 dòng Ulkenia và Labyrinthula. Vị trí của 3 vùng trình tự: Vùng 1 (Hình 4), vùng 2 (Hình 5) và vùng 3 (Hình 6). Dựa vào 3 vùng trình tự này, hai cặp mồi để nhận diện Thraustochytrium và Schizochytrium được thiết kế như sau:
Vùng 1 và vùng 2 tạo thành cặp mồi thứ nhất với kích thước band khoảng 500bp 18S Thraus-Schi1 F: 5’ GCG AAT GGC TCA TTA TAT C 3’
18S Thraus-Schi1 R: 5’ TGC TAT TGG AGC TGG AAT 3’
Vùng 2 và vùng 3 tạo thành cặp mồi thứ hai với kích thước band khoảng 1000bp
18S Thraus-Schi2 F: 5’ ATT CCA GCT CCA ATA GCA 3’
18S Thraus-Schi2 R: 5’ AAA TCT ATC CCC ATC ACG 3’
Hình 4. Vùng đồng hình thứ nhất giữa các dòng Thraustochytrium và
Schizochytrium
Hình 5. Vùng đồng hình thứ hai giữa các dòng Thraustochytrium và
Hình 6. Vùng đồng hình thứ ba giữa các dòng Thraustochytrium và
Schizochytrium
4.2.2. Cặp mồi nhận biết dòng Schizochytrium:
Cặp mồi nhận biết dòng Schizochytrium được thiết kế dựa trên vùng đồng hình của các dòng Schizochytrium nhưng có sự khác biệt với dòng Thraustochytrium (Hình 7 và Hình 8). Kết quả:
18S Schi F 5’ TGG TGA GTC ATG GTA ATT GAG 3’
18S Schi R 5’ GCG GGC AAA CCA ACA AAA 3’
Hình 8. Primer reverse để nhận biêt Schizochytrium
4.2.3. Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium striatum
Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium striatum được thiết kế dựa trên 2 vùng có sự khác biệt lớn giữa Thraustochytrium striatum với các loài họ hàng (Hình 9 và Hình 10).
18S Thraus. striatum 174F 5’ CGA CTT TTA GGG AGG GCT 3’
18S Thraus. striatum 705R 5’ GAA ATG TGA AGG ATG GCC 3’
Hình 9. Primer forward nhận biết Thraustochytrium striatum
4.2.4. Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium aureum
Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium aureum được thiết kế dựa trên 2 vùng có sự khác biệt lớn giữa Thraustochytrium aureum với các loài họ hàng (Hình 11 và Hình 12)
18S Thraus. aureum 171F 5’ CGT ACA GGC CTG ACT TTG 3’
18S Thraus. aureum 716R 5’ AAA AGA CCG GGG GAG GAT 3’
Hình 11. Primer forward để nhận biết Thraustochytrium aureum
Hình 12. Primer reverse để nhận biết Thraustochytrium aureum
4.3. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi thiết kế bằng kỹ thuật PCR: 4.3.1. Kết quả PCR của mồi Thraus-Schi1 (khoảng 500bp) 4.3.1. Kết quả PCR của mồi Thraus-Schi1 (khoảng 500bp)
Thực hiện phản ứng PCR với mồi Thraus-Schi1 với chu kỳ nhiệt ở Bảng 5. Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1,5% Agarose:
Hình 13. Kết quả sản phẩm PCR bằng cặp mồi Thraus-Schi1 được điện di trên gel 1,5% Agarose.
(Từ giếng 1 đến giếng 9 lần lượt là các dòng: B1, B3, M6, M3, M7, M8, M19, M10 và D14. Giếng 10 là đối chứng âm. Giếng cuối (giếng 12) là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas)
Dựa vào kết quả phân tích điện di trên gel Agarose ở Hình 13 cho thấy, các cặp mồi được thiết kế trong nghiên cứu này đã khuyếch đại sản phẩm PCR với kích thước khoảng 500bp đúng với kích thước đoạn gen theo lý thuyết và tất cả các dòng được cung cấp trong thí nghiệm này đều được kiểm tra bằng cặp mồi này và tất cả đều cho ra sản phẩm PCR khoảng trên 500bp. Dựa vào đó cho thấy rằng chín dòng vi tảo này đều thuộc về hai chi Thraustochytrium và Schizochytrium.
Gen mã hóa 18S rDNA là gen được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu cho các loại vi sinh vật nhân thực. Trước đây, Mo et al. (2002) cũng đã sử dụng kỹ thuật PCR để nhận diện 26 dòng thraustochytrid đã được phân lập. Theo Chatdumrong et al. (2007), cặp mồi NS1 và NS8 được sử dụng để khuyếch đại vùng gen 18S rDNA nhằm nhận diện chủng BR2.1.2 là Thraustochytrium aggregatum hay Schizochytrium limacinum. Trong nghiên cứu của Dương Tấn Phát (2013), cặp mồi 1F và 536R đã được thiết kế để nhận diện các dòng vi tảo thraustohytrid phân lập được từ các mẫu lá ở vùng ngập mặn Cà Mau với kích thước khoảng 530-540bp. Vì vậy, kỹ thuật sinh học phân tử mang lại hiệu quả đáng kể trong việc nhận diện vi tảo thraustochytrid.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
4.3.2. Kết quả PCR của mồi Thraus-Schi2 (khoảng 1000bp)
Phản ứng PCR được thực hiện với chu kỳ nhiệt như ở Bảng 6 và sản phẩm điện di trên gel 1,5% Agarose
Hình 14. Kết quả điện di trên gel Agarose 1,5% với mồi Thraus-Schi2
(Giếng 1 là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas, giếng 2 đến giếng 5 lần lượt là dòng B3, D14, M6 và M10, giếng 6 là đối chứng âm)
Kết quả điện di (Hình 14) cho thấy sản phẩm PCR đã khuếch đại một band khoảng 1.000bp đúng như tính toán lý thuyết tuy nhiên các band rất mờ, do đó cần cải thiện điều kiện thực hiện phản ứng PCR.
Thay đổi chu kỳ nhiệt: để cải thiện sản phẩm PCR, thực hiện phản ứng PCR với các chu kỳ nhiệt khác nhau, trong đó thay đổi nhiệt độ giai đoạn bắt mồi trong khoảng từ 56°C đến 52°C và so sánh kết quả điện di trên gel Agarose 1,5%.
Bảng 11. Chu kỳ nhiệt tối ưu hóa cho mồi Thraus-Schi2
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 4 phút 1 2 94 56-52 72 45 giây 45 giây 2 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1 1000bp 1 2 3 4 5 6
Kết quả điện di cho thấy band xuất hiện rõ và sáng ở nhiệt độ bắt mồi là 52°C.
Hình 15. Kết quả điện di trên gel Agarose của mồi Thraus-Schi2 ở nhiệt độ bắt mồi là 52°C
(Giếng 2 đến giếng 6 lần lượt là dòng B3, D14, M6 và M10, giếng 1 là đối chứng âm và giếng 6 là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas)
Tiếp tục thực hiện phản ứng PCR với 9 dòng vi tảo theo chu kỳ nhiệt đã được tối ưu. Dựa vào kết quả điện di (Hình 16) cho thấy rằng 9 dòng vi tảo đều có cùng sản phẩm PCR với 1.000bp. Kết quả này cùng với kết quả phân tích bằng cặp mồi Thraus- Schi1 đã trình bày ờ trên một lần nữa cho thấy các dòng vi tảo này đều thuộc nhóm
Thraustochytrium và Schizochytrium.
Hình 16. Kết quả điện di trên gel Agarose với 9 dòng vi tảo bằng mồi Thraus-Schi2
(Từ giếng 1 đến giếng 9 lần lượt là các dòng: B1, B3, M6, M3, M7, M8, M19, M10 và D14. Giếng 10 là đối chứng âm. Giếng cuối (giếng 11) là thang chuẩn 100bp của công ty Fermentas)
4.3.3. Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium (khoảng 600bp) 600bp)
Thực hiện phản ứng PCR với mồi Schi1 với chu kỳ nhiệt ở Bảng 7
1 2 3 4 5 6
1000bp
Sản phẩm được điện di trên gel Agarose 1,5%
Hình 17. Kết quả sản phẩm PCR với mồi Schi điện di trên gel 1,5% Agarose
(Từ giếng 1 đến giếng 9 lần lượt là các dòng: B1, B3, M6, M3, M7, M8, M19, M10 và D14. Giếng 10 là đối chứng âm. Giếng cuối (giếng 11) là thang chuẩn 800bp)
Dựa vào kết quả điện di trên gel Agarose 1,5% (Hình 17) cho thấy có 7 dòng đã khuếch đại được sản phẩm PCR với kích thước 600bp đúng như lý thuyết, điều này có thể nhận định được rằng trong số 9 dòng vi tảo thì có 7 dòng thuộc Schizochytrium
(bao gồm: dòng B1, B3, M3, M6, M7, M8 và M10). Kết hợp với kết quả nhận diện của 2 cặp mồi Thraus-Schi1 và Thraus-Schi2 cho thấy dòng D14 và M19 thuộc chi
Thrasutochytrium
4.3.4. Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium striatum
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng vi tảo
Thraustochytrium striatum với chu kỳ nhiệt ở Bảng 8. Sản phẩm được điện di trên gel Agarose 1,5%
Phản ứng PCR được thực hiện với nhiệt độ bắt mồi được thay đổi trong khoảng từ 52°C đến 56°C, nhưng kết quả tất cả 9 mẫu DNA đều không có band khoảng 531 xuất hiện. Như vậy, chín dòng vi tảo đều không thuộc loài vi tảo là Thraustochytrium striatum. Kết hợp với kết quả của cặp mồi chuyên biệt cho dòng Schizochytrium cho thấy, 7 dòng vi tảo thuộc dòng Schizochytrium, chỉ có 2 dòng D14 và M19 thuộc chi
Thraustochytrium. Từ đó cho thấy 2 dòng vi tảo D14 và M19 đều không thuộc
Thraustochytrium striatum. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 800bp bv p 600bp bv p
4.3.5. Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium aureum
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng vi tảo
Thraustochytrium aureum với chu kỳ nhiệt ở Bảng 9. Sản phẩm được điện di trên gel Agarose 1,5%.
Phản ứng PCR được thực hiện với nhiệt độ bắt mồi được thay đổi trong khoảng từ 52°C đến 56°C, nhưng kết quả tất cả 9 mẫu DNA đều không có band khoảng 545 xuất hiện. Như vậy, chín dòng vi tảo đều không thuộc loài vi tảo Thraustochytrium aureum. Kết hợp với kết quả của cặp mồi chuyên biệt cho dòng Schizochytrium cho thấy, có 7 dòng đều thuộc dòng Schizochytrium, chỉ có 2 dòng D14 và M19 thuộc chi
Thraustochytrium. Từ đó cho thấy 2 dòng vi tảo D14 và M19 đều không thuộc
Thraustochytrium aureum.
4.4. Giải trình tự
Ba dòng vi tảo B3, M6 và D14 được tiếp tục sử dụng để giải trình tự nhằm kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi chuyên biệt đã thiết kế. Việc lựa chọn 03 dòng vi tảo này dựa trên những cơ sở sau: Thứ nhất, ba dòng vi tảo này được phân lập từ 3 loại lá khác nhau là lá bần (dòng B3), lá đước (dòng D14) và lá mắm (dòng M6). Thứ hai, các mẫu lá được lấy từ 2 tỉnh khác nhau là Bến Tre (B3 và M6) và Trà Vinh (D14). Thứ ba, dựa vào kết quả phân tích bằng cặp mồi chuyên biệt đã thiết kế trong nghiên cứu này, dòng B3 và M6 thuộc chi Schizochytrium và dòng D14 thuộc chi Thraustochytrium. Thêm vào đó, cả 3 dòng vi tảo này đều có khả năng sản xuất được DHA và DPA khá cao (Theo báo cáo của Trần Thị Xuân Mai et al., 2014)
Sản phẩm PCR của 3 dòng vi tảo B3, D14 và M6 bằng cặp mồi Thraus-Schi2 (khoảng 1.000bp) được đem giải trình tự.
Kết quả trình tự: - Dòng B3: CCAAGCATATGCCAAAACGTGTGCCACATAAAAAAGCTNGTANGTAA ATTTTCTGCGATGGGCGANCGGGTGGTCTCTCCCTGAANGGGGATGAATTN NCNGGTGCCTTNGCCCATTTTTTCTTCTTTTNGGGGGAGAATTTTTCACTGA AAACAAACAAGGTTTCCCAAACCAGGTTTTTGACCCGGATATTTTTTTTAG GGAAAAAAGAAAGGGCTTGGGGGGCTTTTTTTTGGTTTCCCCCCCTGAAAA AGGTTAAAAGGAACACTTGGGGGGATTTGTTTTTTGGGGCTTAGGGGGAA
ATTTTTGGATTTTCGAAAAACCGAATTAAGGGGAGGCCTTTTCCAAACAAG TTTTCCTTAAACAAGAAAAAAAATTTGGGGGTTGAAAAAGATTTAAAACC ATTGGGGTTTAGGCCCTAAAAAAAGCCCACCTGGGAATTTTGGGGGCTTTT TTTAAGGGCCTCAGCAGCCGCCCCTGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGG GGGGGGTATGGTTGCAAGGGTGAAAATTAAAGGAAATGGCGGAAGGGCC CCCCCCGGGGGGGGGCCCGCGGGTTAATTTGACTCAACCCGGGAAAAATT TCCCGGTCCCGACAAAGGGAGGATTGACAGATTGAGGGGTTTTTCAAGGTT TTATGGGGGGGGGGGCATGGCCGTTTTTAGGTGGGGGGGGGAATTGTTTG GGTAATTCCGTTAAAGAAAGGGACCTCGGCCTACTAAAAAGGGGGGGGGA AGGCAACAAAGGACGTTTTTAACTTTTTAAAGGGACATGTCCGGTTTACGG GCAGGAAGTTGGAGGCAATAACAGGTTGGGGATGCCCTTAAAGGTTTTGG GCCCCCCCCCCGCTCCACTAAGGGGTTCATCGGGTTTAAATTCAATATTTA TGGATATTGAGTGCTTCTAGGAATGG
Khi so sánh trình tự gen dòng B3 với ngân hàng GenBank trên NCBI đã cho thấy được dòng B3 có sự đồng hình với Schizochytrium sp. SKA10 với 79%.
Hình 18. Kết quả BLAST từ NCBI của dòng B3
- Dòng 14: AGTAGTTGAATTATCTTANGCACTGGGTCGACCGGTGCTTTCCTATGA ATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTTTCTTTTCTTTATTGG GGAGAAATCTTTCACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATG ACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGT TGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTA TTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGC GAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGG ATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACT TGCGATTGTTGGGTGCTTTTTTATGGGCCCCACCACCACCCCACGAGAAAA
CTAAATCTTTTGGGTCCCGGGGGGGAATGGGCCCAAGGGGGAAACTCTAA GGAAATTAGGGAAAGGGACCCCCCGGGGTGGGGCCCGCGGGTTTATTTTA CTCTCAACGGGAAAACTTTCCCCGGGCCCACACATGGGGGGTTTTCACATT TAGAGCTCTCTCTCGAGACTATGGGGGGGGGGGCGCGGGGCCTCTCATTTT GGGTAGAGATATGTGTGGGGAATTCCCTGTACGCACGAGACCCCGCGCTCT CCTAAATGGCGTGTGGTGGGCCCATATAAAGCTTTTACGCTTTAAAACGGG CATTTTGCGTGTATCGGGGCGGAAATCTAGGGAAATACAGTCCTGTGAAGC CACTCAAAGATTATGGGCGCANCGCCGCATCAGATGGCGCTGTCGAGGGT GTATAATCTGTTTCTATGCATATNAGAGATATACAGAAGGTCTTGGAGAAG CTCGTGTAA
Khi so sánh trình tự gen dòng D14 với ngân hàng GenBank trên NCBI đã cho thấy được dòng D14 có sự đồng hình với Thraustochytrium sp. BP3.2.2 với 93%.
Hình 19. Kết quả BLAST từ NCBI của dòng D14
- Dòng M6 TATATAATAAATANNCCTTTTCTTATTTCCCCGCTCCAATAGCAATAT GCTAAACGTTGTCTGCAGATAAAAAAGCTCGTAGTTGAAATTCTTGGCATG GGCCGACCGGTGCTTTTCCCTGAAATGGGGATTGATTTGTCTGTGTTGCCTT GGCCATTTTTTTCTTTTCTTTATTGATAAGAAATCTTTCACTGTAATCAAAG CAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATA AGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTA ATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTG GATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCAT TAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAG TCTAGACCGTAAACGATGCCGACTTGCGATTGTTGGGTGCTTTTTTTATGG GCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAG TATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAG
GAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGT CCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTATGGG TGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCC GTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACAT AGTACGTTTTAACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTT CGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTTTGGGCCGCACGCGC GCTACACTGATGGGTTCATTAGGGCAGAGTTATATTTTAGGATATTGACTG CTTCT
Khi so sánh trình tự gen dòng M6 với ngân hàng GenBank trên NCBI đã cho