Honda et al. (1999) đã có những nghiên cứu về trình tự 18S rDNA của một số nhóm thuộc thraustochytrid và đã xây dựng thành công hệ thống cây phát sinh loài. Những kết quả đạt được đã thúc đẩy các nghiên cứu sâu hơn về vi tảo thraustochytrid, cũng như mang lại kiến thức nền cho những nghiên cứu về phân lập thraustochytrid bằng dấu phân tử 18S rDNA.
Trong thí nghiệm của Mo et al. (2002), ba bộ mồi được thiết kế trên vùng 18S rDNA để phân loại những chủng thraustochytrid. Với 26 dòng vi tảo phân lập được kiểm tra bằng phương pháp PCR, bài nghiên cứu cho thấy rằng không phải tất cả đều giống nhau về các band PCR, chứng tỏ sự đa dạng trong nhóm vi tảo này. Từ đó, Mo đưa ra kết luận rằng dựa vào kỹ thuật PCR trong phân loại vi tảo dựa trên vùng 18S rDNA là một cung cấp hữu hiệu trong việc nghiên cứu vi tảo thraustochytrid.
Cavalier-Smith et al. (1994) đã cho thấy rằng trình tự 18S rDNA của những dòng vi tảo có sự khác biệt so với những loài sinh vật nhân thực khác ở chuỗi xoắn 47 trong vùng V9.
Theo nghiên cứu của Yang et al. (2009) trên các dòng vi tảo ở Đài Loan, những loài vi tảo dị dưỡng có khả năng cung cấp DHA như thraustochytrid có thể được phân
lập, nuôi cấy và phân loại dựa trên vùng trình tự 18S rDNA và những đặc trưng hình thái học. Kết quả đạt được là đã phân lập được 25 chủng vi tảo dụ dưỡng ở vùng biển Đài Loan. Những chủng này có họ hàng thân thiết với nhau và với họ Thraustochytriaceae dựa trên nghiên cứu trong vùng 18S rDNA.
Trong nghiên cứu của Lê Bích Tuyền (2013), 13 dòng vi tảo đã được phân lập từ các mẫu lá đước và bần ở ven biển các tình Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh. Dựa vào các kiểm tra đặc tính trên khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khảo sát PCR với mồi chuyên biệt trên vùng 18S rDNA đã xác định các dòng vi tảo này thuộc thraustochytrid. Nghiên cứu tiếp theo dựa trên giải trình tự cũng cho thấy rằng dòng D5 (dòng có sản lượng carotenoid cao nhất) có sự đồng hình 96% đối với trình tự của Thraustochytrium aurantiochytrium sp. B072. Từ đó, cho thấy rằng những giống vi tảo thraustochytrid ở vùng biển Việt Nam có họ hàng thân thuộc với những giống vi tảo đã được nghiên cứu trên thế giới.
Dương Tấn Phát (2013) đã phân lập được 9 dòng vi tảo dị dưỡng dựa trên các mẫu lá thu về từ rừng ngập mặn ở tỉnh Cà Mau. Bên cạnh sự nhận diện sơ bộ bằng hình thái, nghiên cứu còn sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để nhận diện những dòng vi tảo được phân lập bằng cặp mồi chung được thiết kế cho trình tự gen mã hóa 18S rDNA của một số loài thuộc thraustochytrid. Dương Tấn Phát (2013) đã kết luận rằng tất cả những dòng vi tảo được phân lập đều có thể thuộc về những loài mục tiêu này.
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN 3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 11 năm 2014 tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật và phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử của Viện Nghiện cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Chín dòng vi tảo được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật của Viện Nghiện cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Đại học Cần Thơ.
Bảng 3. Các dòng vi tảo và nguồn gốc các dòng vi tảo đã phân lập
STT Ký hiệu Nguồn Địa điểm thu mẫu
1 B1 Lá Bần Bến Tre 2 B3 Lá Bần Bến Tre 3 M3 Lá Mắm Bến Tre 4 M6 Lá Mắm Bến Tre 5 M7 Lá Mắm Bến Tre 6 M8 Lá Mắm Bến Tre 7 M10 Lá Mắm Trà Vinh 8 M19 Lá Mắm Trà Vinh 9 D14 Lá Đước Trà Vinh 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ 3.1.3.1. Thiết bị - Tủ cấy vô trùng
- Máy khử trùng nhiệt ướt - Máy li tâm
- Cân điện tử
- Máy đo OD Backman Coulter - Máy PCR BioRAD
- Bộ điện di ngang
- Tủ mát 4-10oC (Alaska) - Tủ lạnh -20oC (Akira) - Máy ly tâm chân không
3.1.3.2 Dụng cụ
- Micropipette, đầu cone - Đèn cồn
- Ống fancol 15 ml - Chai nắp xanh.
- Tube Eppendorf 1,5 ml và 2,2 ml, tube PCR. - Khay đựng nước đá
- Ống đong, kéo
3.1.4. Hóa chất
- Cồn tuyệt đối và 70% (ethanol), cát thủy tinh.
- Hóa chất trích DNA và thực hiện phản ứng PCR như: Extraction buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8), 500 mM NaCl, 50 mM EDTA; trước khi sử dụng cho thêm 10 mM beta mercapthoethanol (7 µl beta mercapthoethanol cho 10 ml dung dịch trích EB)), TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8 và EDTA 1 mM, pH 8), Buffer, dNTPs, MgCl2 1,5 mM, Taq polymerase…
- Hóa chất thực hiện điện di: Agarose, đệm điện di TBE 1X (Tris base 10,8 g, Boric acid 5,5 g/L, EDTA 0,5 M 4 ml), Loading buffer (3 ml glycerol 30%, 20 mg bromophenol blue 0,25%, 200 mM Tris, 20 mM Na2EDTA, nước cất vừa đủ 10 ml, bảo quản 4oC), SafeView (10 mg/ml).
- Thang chuẩn 100 bp của công ty Fermentas.
3.2. Phương pháp
3.2.1. Quy trình nuôi tăng sinh khối vi tảo
Để tăng sinh khối của vi tảo giúp thu được nhiều DNA, vi tảo sẽ được nuôi tăng sinh khối với thể tích lớn hơn. Môi trường được dùng để nuôi tăng sinh là môi trường NM-5, vi tảo được cấy vào các ống fancol 15 ml đã có chứa sẵn môi trường. Sau đó, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong 4 ngày.
Bảng 4. Thành phần môi trường NM-5 Thành phần Nồng độ D – Glucose 50 g/l Yeast extract 10 g/l Peptone 10 g/l NaCl 1 g/l MgSO4 10 g/l
Nước cất Thêm cho đủ 1 lít
Streptomycin (Strep) 300 mg/l
Ampicillin (Amp) 200 mg/l
(Nguồn: Trần Thị Xuân Mai et al., 2014)
3.2.2. Quy trình trích DNA vi tảo bằng CTAB
Quy trình trích dựa theo quy trình trích CTAB của Roger và Bendich (1988) có chỉnh sửa và bổ sung.
- Quy trình căn bản được dựa theo quy trình trích DNA bằng CTAB của Rogers và Bendich (1994) nhưng có thêm một số bước thay đổi: Dung dịch vi tảo (10ml) được nuôi cấp I và được thu sinh khối bằng cách ly tâm ở vận tốc 5.000 vòng/ phút trong 10 phút. Chuyển phần tủa vào trong một cối bằng sứ, cho một lượng tương đương cát thủy tinh đã khử trùng vào cối, thêm 4 ml dịch trích (100 mM Tris-HCl (pH8), 500 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM beta mercaptho ethanol), dùng chày nghiền kỹ. Chuyển 2 ml dung dịch vi tảo vào tube eppendorf mới. Thêm 100 µl SDS 10% vào tuýp. Trộn đều, tránh lắc mạnh. Ủ ở 65°C trong 30 phút, khoảng 5 phút đảo nhẹ tuýp để trộn mẫu. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần trong vào tuýp mới, thêm một lượng tương đương isopropanol, ủ 20 phút trên khay nước đá. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ phần dung dịch, hòa tan tủa DNA với 500 µl TE 1X. Thêm 500 µl dung dịch đệm CTAB và ủ ở 65°C trong 15 phút. Thỉnh thoảng đảo tuýp để trộn đều mẫu. Thêm 1 ml Chloroform: Isoamylalcohol và trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần dung dịch trong qua tuýp mới. Thêm 1 ml Ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, đổ bỏ phần dung dịch và rửa phần tủa với 500 µl Ethanol 70%. Thực hiện thao tác rửa 2 lần. Loại bỏ dung dịch Ethanol 70%. Sấy khô DNA với máy ly tâm chân không ở 45°C trong 30 phút. Hòa tan DNA với 100 µl nước cất vô trùng, trữ ở -20°C.
3.2.3. Phản ứng PCR
Việc nhận diện dòng vi tảo Thraustochytrid được tiến hành bằng kỹ thuật PCR đơn mồi.
Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 µl/tube.
Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần: 75 mM Tris HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4; 0,1% Triton X-100; 0,5% DMSO, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mỗi loại, 200 nM mỗi loại mồi, 1,25 unit Taq polymerase, 1,5 µl PVP và 50-100 ng DNA. Thêm nước cất vô trùng cho đủ thể tích 25µl. Sau khi có kết quả thiết kế các cặp mồi, chu kỳ nhiệt PCR được tính toán tối ưu để phù hợp với nhiệt độ nóng chảy Tm của các cặp mồi.
Cho các tube PCR vào máy PCR Bio-Rad DNA và thiết lập chu kỳ nhiệt phản ứng trên máy.
Bảng 5. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi1
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 54 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 6. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi2
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 4 phút 1 2 94 54 72 45 giây 45 giây 2 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 7. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Schi
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 55 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 8. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus. striatum 174F và 705R
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 56 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
Bảng 9. Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thaus. aureum 171F và 716R
Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian Số lần lặp lại
1 94 3 phút 1 2 94 56 72 30 giây 30 giây 1 phút 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
3.2.4. Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose
Đối với gel nhỏ, agarose 1,5%: Chuẩn bị 20ml dung dịch đệm TBE 1X, cân 0,3g agarose cho vào chai nắp xanh. Đậy nắp cho vào lò vi sóng đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ khoảng 50-600C thì thêm vào 0,4 µl nhuộm SafeView. Lắc nhẹ và đổ vào khay điện di đã có gắn lược và để ở vị trí cân bằng. Sau khoảng 30 phút, gel đông cứng hoàn toàn, lấy nhẹ lược ra khỏi.
Chuyển gel vào trong bể điện di có chứa TBE.
Nhỏ loading buffer thành những giọt nhỏ (khoảng 2µl) trên giấy parafin. Trộn 10 µl DNA mẫu với loading buffer, sau đó nhỏ (load) vào từng giếng. Tương tự như vậy với đối chứng âm, đối chứng dương vào thang chuẩn.
Thực hiện điện di ở 100V cho đến khi vạch màu của loading buffer được khoảng 2/3 gel thì lấy gel ra khỏi bể điện di.
Chụp hình gel bằng máy Biorad UV 2000, ghi nhận kết quả. Các sản phẩm PCR được xác định bằng cách so với các vạch của đối chứng dương và vạch của thang chuẩn.
3.2.5. Phân tích các trình tự bằng phương pháp xây dựng cây phả hệ
Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose sẽ được tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch của Promega (Mỹ) và được giải trình tự cả hai hướng 5’ và 3’ bằng máy giải trình tự DNA tự động ABI 3130 (Mỹ). Các kết quả giải trình tự gen 18S rDNA được so sánh với các trình tự nucleotid đã được công bố từ dữ liệu trong ngân hàng gen (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) bằng cách tìm kiếm các trình tự nucleotid đồng hình qua sử dụng chương trình nucleotid BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Sử dụng các trình tự đã công bố để so sánh vùng tương đồng bởi clustalW, từ đó cây phả hệ được xây dựng với phần mềm MEGA version 6.0 sử dụng bootstrap phân tích các mẫu với 1.000 lần.
3.3. Bố trí thí nghiệm
3.3.1. Thiết kế các đoạn mồi PCR
Mục đích: thiết kế được cặp mồi chuyên biệt cho các dòng vi tảo Thraustochytrid Thực hiện: các trình tự đoạn gen 18S rDNA của các vi tảo thuộc các dòng Thraustochytrid được lấy từ ngân hàng gen của NCBI. Các cặp mồi chuyên biệt được thiết kế dựa trên các trình tự 18S rDNA của các dòng vi tảo mục tiêu bằng phần mềm DNAMAN 4.0. Sau đó được đặt hàng và sử dụng trong phản ứng PCR.
3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi
Mục đích: đánh giá tính chuyên biệt của các cặp mồi đã thiết kế dùng để xác định vi tảo Thraustochytrid bằng kỹ thuật PCR.
Thực hiện: sau khi trích DNA các chủng vi tảo phân lập được của phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật, tiến hành thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi
chuyên biệt sẵn có và cặp mồi tự thiết kế nhằm xác định độ đặc hiệu của cặp mồi thiết kế.
Chu trình nhiệt phản ứng sẽ được điều chỉnh sao cho phù hợp với cặp mồi sử dụng. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose nồng độ thích hợp trong đệm điện di TBE 1X.
3.3.3. Thực hiện giải trình tự các dòng vi tảo phân lập:
Mục đích: kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế
Thực hiện: chọn ra 2-3 dòng vi tảo để xác định trình tự nhằm đánh giá tính chuyên biệt của các mồi. Sản phẩm PCR bằng cặp mồi chung Thraus-Schi2 sẽ được giải trình tự bằng máy giải trình tự ABI3130 của phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Cần Thơ.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quan sát các dòng vi tảo dưới kính hiển vi:
Hình 3. Kết quả quan sát 9 dòng vi tảo dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000X) A: Dòng B1 B: Dòng B3 C: Dòng M6 D: Dòng M3 E: Dòng M7 F: Dòng M8 G: Dòng M19 H: Dòng M10 I: Dòng D14 A B C D E F G H I
Bảng 10. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập
Dòng vi tảo
Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch NM-5
Đặc điểm hình thái tế bào vi tảo
B1 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt trơn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng sữa.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-8 µm, sống riêng lẻ.
B3 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt bóng ướt, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu trắng đục, khi già chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 20 µm, sống tập đoàn.
M3 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt khô, khuẩn lạc có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 8 - 12 µm, sống thành tập đoàn.
M6 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt nhẵn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng đục sau đó chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5-12 µm, sống riêng lẻ.
M7 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt nhẵn, khô, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu hồng nhạt, khi già có màu hồng đậm hơn.
Hình bầu dục, đường kính khoảng 3-7 µm, đơn bào, sống tập đoàn.
M8 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt bóng, ướt, khuẩn lạc có màu hồng nhạt sau đó chuyển sang màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 3 - 8 µm, sống tập đoàn
M10 Khuẩn lạc hình thành sau 3-4 ngày, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 15 – 20 µm, sống tập đoàn.
M19 Khuẩn lạc hình thành sau 1-2 ngày, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu vàng nhạt, khi già có màu vàng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 2-14 µm, sống riêng lẻ.
D14 Khuẩn lạc hình thành sau 2-3 ngày, bề mặt khô, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng nhạt.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-6 µm, sống tập đoàn
Dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào theo như mô tả của Arafiles et al. (2011), chín dòng vi tảo đã được nhận diện bước đầu là vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrid. Tuy nhiên cho đến nay nhóm Thraustochytrid đã có ít nhất là 6 chi bao gồm: Thraustochytrium, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium và Ulkenia. Theo cách phân loại truyền thống của chúng chủ yếu dựa trên các giai đoạn phát triển vòng đời, sự hiện diện của các bào tử động