cuống lá cây Đương quy Nhật Bản in vitro
3.4.1. Kết quả
3.4.1.1. Thí nghiệm 4a: Mẫu cấy phiến lá
Nguồn carbohydrate có ảnh hưởng lên sự hình thành mô sẹo ở phiến lá cây Đương quy Nhật Bản (Hình 3.16).
Hình 3.16. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 25. Thanh ngang: 1 mm
Ghi chú: G hoặc S bên trái đại diện cho glucose hoặc sucrose; số bên phải G hoặc S đại diện cho nồng độ 10, 30 hoặc 50 g l-1
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Qua theo dõi thí nghiệm ở ngày nuôi cấy thứ 25, mẫu cấy ở các nghiệm thức trên môi trường có bổ sung 50 g l-1
glucose và 30 g l-1 sucrose cho biểu hiện mẫu khá tốt, mẫu cho mô sẹo sớm và có những phản ứng với môi trường tốt hơn các nghiệm thức khác. Giữa 2 nghiệm thức G50 và S30, mẫu cấy ở môi trường có bổ sung 30 g l-1 sucrose cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao hơn (11,11%) (Bảng 3.11). Đến ngày thứ 25, các mẫu cấy trên các nghiệm thức khác đều có phản ứng với môi trường như
mẫu cấy trương phồng, phiến lá to và cong lại, một số mẫu cấy chuyển từ màu xanh sang màu vàng, một số mẫu chuyển sang màu vàng trắng hoặc màu nâu sậm (Hình 3.16)
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 25
Nghiệm thứcx
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) G10 0,00 0,00 G30 3,70 0,00 G50 0,00 0,00 S10 0,00 0,00 S30 11,11 0,00 S50 0,00 0,00 ANOVAy
Loại đường (A) ns
Nồng độ (B) ns
AxB ns
CV (%) 335,41
Ghi chú: y ns: không khác biệt.
x
G hoặc S bên phải đại diện cho glucose hoặc sucrose, số bên phải G hoặc S đại diện cho nồng độ 10, 30 hoặc 50 g l-1
.
Tỷ lệ mẫu tạo rễ
3.4.1.2. Thí nghiệm 4a: Mẫu cấy cuống lá
Hình 3.17. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở cuống lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42. Thanh ngang: 1 mm Ghi chú: G hoặc S bên trái đại diện cho glucose hoặc sucrose; số bên phải G hoặc S đại diện cho nồng độ 10, 30 hoặc 50 g l-1
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Quan sát mẫu cấy ở ngày thứ 25 của thí nghiệm, mẫu cấy cuống lá ở các nghiệm thức đều có biểu hiện chung như cuống lá cong lên, sậm màu hơn hoặc mất màu. Mẫu cấy ở nghiệm thức S30 đã hình thành mô sẹo nhưng chưa nhiều và chưa có mẫu cảm ứng tạo rễ (Bảng 3.12). Mẫu cấy hóa nâu hoặc mất màu vàng tăng dần ở các nghiệm thức có bổ sung từ 10 đến 50 g l-1
glucose. Mẫu cấy ở các nghiệm thức có bổ sung sucrose có tỷ lệ mẫu nâu thấp hơn so với các nghiệm thức bổ sung glucose.
Tỷ lệ mẫu tạo rễ
Đến ngày thứ 25 của thí nghiệm, vẫn chưa có mẫu cấy đáp ứng tạo rễ (Hình 3.17)
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy cuống lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 25 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiệm thứcx
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) G10 0,00 0,00 G30 3,70 0,00 G50 0,00 0,00 S10 0,00 0,00 S30 11,11 0,00 S50 0,00 0,00 ANOVAy
Loại đường (A) ns
Nồng độ (B) ns
AxB ns
CV (%) 335,41
Ghi chú: y ns: không khác biệt.
x
G hoặc S bên phải đại diện cho glucose hoặc sucrose, số bên phải G hoặc S đại diện cho nồng độ 10, 30 hoặc 50 g l-1
.
3.4.2. Thảo luận
Sự ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự hình thành rễ bất định ở cây Đương quy Nhật Bản
Trong nuôi cấy mô thực vật, sự cung cấp liên tục nguồn carbohydrate là rất cần thiết và quan trọng để giúp mẫu cấy tồn tại và kích thích sự sinh trưởng cũng như các hoạt động sinh tổng hợp của mẫu cấy (Kadota, 2004). Các loại đường thường được sử dụng để cung cấp nguồn carbon là glucose hay sucrose. Sau 25 ngày, mẫu cấy ở các nghiệm thức có bổ sung glucose hay sucrose với nồng độ 10 g l-1 trên môi trường có biểu hiện kém như hóa nâu, chưa có sự hình thành mô sẹo có
thể là do nguồn carbohydrate không đủ cung cấp cho mô cấy tiếp tục hoạt động sinh tổng hợp các chất cần thiết nên mẫu cấy có biểu hiện như mất màu xanh, chuyển màu vàng úa hoặc trắng. Trong khi ở các nghiệm thức có bổ sung 50 g l-1
glucose và 50 g l-1 sucrose, mẫu cấy hoá nâu sậm do nồng độ carbohydrate trong môi trường quá cao, làm cho môi trường trở nên ưu trương, nước vận chuyển theo cơ chế thụ động vì thế nước trong tế bào sẽ di chuyển ra ngoài, gây mất nước ở mẫu cấy dẫn đến sự thiếu nước trong mẫu cấy, làm tích tụ chất hoàn tan, cản trở sự tổng hợp protein, kéo dài và phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2002).
Mẫu cấy trong môi trường có bổ sung 30 g l-1 glucose và 30 g l-1 sucrose có sự xuất hiện mô sẹo ở phiến lá hoặc cuống lá, điều này, cho thấy nồng độ 30 g l-1 là thích hợp cho mẫu cấy hình thành mô sẹo và cảm ứng tạo rễ bất định. Nghiên cứu trên cây táo của Pue và Chong (1985) và mận (Marino và cs, 1991, 1993) cũng cho kết quả là sucrose thích hợp cảm ứng cho mẫu cấy tạo rễ giống như ơ cây Đương quy Nhật Bản.
3.5. Quan sát hình thái
Hình 3.18. Mô sẹo ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá dưới kính lúp ở nghiệm thức được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 6 mg l-1IBA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin ở ngày nuôi cấy thứ 21. Thanh ngang: 5 mm
Hình 3.19. Hình thái giải phẫu (a) phiến lá và (b) cuống lá quan sát dưới kính hiển vi sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 6 mg l-1 NAA kết hợp với 1 mg l-1kinetin (nghiệm thức N6K1).
Quan sát mẫu cấy dưới kính lúp ở ngày thứ 21 cho thấy mô sẹo và rễ được hình thành tại vị trí vết thương của mẫu cấy. Mô sẹo là những khối tế bào màu vàng hoặc trắng nhạt, thời gian nuôi cấy càng dài thì mô sẹo càng ngã màu nâu sậm. Các sơ khởi rễ đâm chóp rễ ra khỏi đám tế bào mô sẹo hình thành rễ dài, có nhiều lông hút ở các nghiệm thức được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung NAA, ngược
lại mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IBA lại ít lông hút (Hình 3.7).
Hình 3.20. Mẫu cấy phiến lá quan sát dưới kính hiển vi sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường Gamborg B5 có bổ sung 6 mg l-1 NAA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức B2)
Hình 3.21. Mẫu cấy cuống lá quan sát dưới kính hiển vi sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường Gamborg B5 có bổ sung 6 mg l-1 NAA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức B2)
Cây Đương quy là cây 2 lá mầm, có hệ thống gân mạng lưới chằng chịt nên khi có vết thương đều cắt ngang qua đám tế bào nhu mô và bó libe - mộc. Tại đây, dưới tác động của thành phần môi trường và các CĐHSTTV làm cho đám tế bào phản ứng lại stress do vết thương gây ra phản ứng phản biệt hoá và hình thành nên đám mô sẹo. Rễ có nguồn gốc từ nhu mô quanh bó libe - mộc, phản biệt hoá hình thành sơ khởi rễ, sơ khởi rễ này tiếp tục hoàn thiện cấu trúc và đâm ra bên ngoài (Hình 3.20 và 3.21)
CHƯƠNG 4.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Môi trường nuôi cấy thích hợp của cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro tạo rễ bất định:
- Thành phần khoáng Gamborg B5 kết hợp với vitamin Gamborg B5 - Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: NAA 6 mg l-1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
kết hợp với BA ở nồng độ 0,1 hay 0,5 mg l-1 hoặc kinetin ở nồng độ 1 mg l-1 . - Sucrose nồng độ 30 g l-1 .
Điều kiện nuôi cấy thích hợp của cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro tạo rễ bất định:
- Điều kiện ánh sáng: tối hoàn toàn - Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 24+2 o
C - Độ ẩm 65 + 5 %
- Thời gian nuôi cấy: 42 ngày
Loại mẫu cấy thích hợp của cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy
in vitro tạo rễ bất định:
- Phiến lá của lá mở thứ 2 tính từ chồi ngọn xuống
- Cuống lá của lá thứ 2 và lá thứ 4 tính từ chồi ngọn xuống
4.2. Đề nghị
- Tiếp tục khảo sát 1 số điều kiện vật lý như ánh sáng, nhiệt độ hay độ ẩm lên sự phát sinh rễ bất định cho cây Đương Quy Nhật Bản.
- Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khí CO2, ethylene trong bình nuôi cấy lên sự phát sinh rễ bất định cho cây Đương Quy Nhật Bản.
- Tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy cấy lên sự phát sinh rễ bất định cho cây Đương Quy Nhật Bản.
- Tiếp tục khảo sát sự tăng sinh khối của rễ trong môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh, lỏng lắc cho cây Đương Quy Nhật Bản.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Vũ Ngọc Anh, Nguyễn Lê Anh Thư, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Thị Quỳnh (2011), “Nghiên cứu sự phát sinh rễ từ phiến lá cây Đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa nuôi cấy
in vitro”, Kỷ yếu (tóm tắt) - Hội nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc – Khu vực Phía Nam lần II, tr 183.
2. Nguyễn Bá (2007), Giáo trình thực vật học, NXB Giáo dục, tr 172, 280 trang. 3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong,
Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 1138 trang.
4. Nguyễn Gia Chấn, Lê Minh Phương, Bùi Thị Bằng (1998), “Tác dụng phục hồi miễn dịch của polysaccharide chiết xuất từ rễ cây Đương quy (Angelica acutiloba Kitagawa) thông qua thông báo số 2: Tác dụng phục hồi đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào”, Tc Dược liệu, 3 (3), tr 72-75.
5. Trương Thị Đẹp (2007), Thực vật dược-chương 3, NXB y học.
6. Nguyễn Thị Ngọc Hương và Võ Thị Bạch Mai (2009), “Tìm hiểu sự phát sinh hình thái rễ trong nuôi cấy in vitro cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.”);Tc phát triển Khoa học và Công nghệ, 12 (17), tr 100-105.
7. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011), “Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis,
Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro”, Tc Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 27, tr 30-36.
8. Lê Kim Loan, Bùi Thị Bằng, Lê Tùng Châu (1998), “Nguyên cứu tác dụng của Đương quy Nhật Bản và Đương quy Trung Quốc với hệ đông máu in vitro”, Tc dược liệu, 4 (4), tr 112-115.
9. Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Ngọc Nhung, Tô Thị Hạnh Dung (2011), “Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo chồi của cây Đương quy Nhật Bản”, Kỷ yếu tóm tắt - Hội nghị Công Nghệ Sinh học toàn quốc – Khu vực Phía Nam lần II, tr 159.
10. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2009), Công nghệ sinh học tế bào - Cơ sở công nghệ sinh học – tập 3, NXB Giáo dục Việt Nam.
11. Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), Thực vật cao cấp, NXB Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 211 trang.
12. Nguyễn Trung Thành, Paek Kee Yoeup (2008), “Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm Panax ginseng C.A.Meyer: ảnh hưởng của một số nhân tố lý hóa lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides”, tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và công nghệ, 24, tr 318-323. 13. Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật - phần I: Dinh dưỡng, NXB Đại học (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 349 trang.
14. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật - phần II: Phát triển, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 333 trang.
15. Phạm Văn Ý (2000), “Nghiên cứu, tuyển chọn và xây dựng quy trình sản xuất Angelica acutiloba Kitagawa di thực vào miền Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sĩ, Viện khoa học Kỹ thuật nông nghiệp, tr 28-31.
Tài liệu nước ngoài
16. Blačková A, Sotta B, Tranvan H, Maldiney R, Bonnet M, Einhorn J (1997), “Auxin metabolism and rooting in young and mature clones of Sequoia sempervirens”, Physiol. Plant, 99, pp 73-80.
17. Caboni E, Tonelli MG, Lauri P, Iacovacci P, Kevers C, Damiano C (1997), “Biochemical aspects of almond microcuttings related to in vitro rooting ability”, Biol. Plant, 39, pp 91-97.
18. Capelle SC, Mok DWS, Kirchner SC, Mok MC (1983), “Effects of thiadiazron on cytokinin autonomy and metabolism of N6- (2- isopentyl) [8-14C] adenosine in callus tissue of Phaseolus lunatus L.”, Plant Physiol., 73, pp 796- 802.
19. Chee P.P. (1995), “Stimulation of adventitious rooting of Taxus species by thiamine”, Plant Cell Rep., 14, pp 753-757.
20. Chilton MD, Tepfer DA, Petit A, David C, Casse-Delbart F, Tempe J (1982), “Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells”, Nature, 295, pp 432-434.
21. Cooper WC (1935), “Hormones in relation to root formation on stem cuttings”, Plant Physiol., 10, pp 789-794.
22. Fukuda K, Murata K, Matsuda H, Taniguchi M, Shibano M, Baba K, Shiratori M, Tani T (2009), “Quality of Angelica acutiloba roots cultivated and processed in Sichuan province of China”, J. Trad. Med , 26 (4), pp 169- 178.
23. Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968), “Nutrient requirement of suspensions cultures of soybean root cells”, Exp. Cell Res., 50, 151.
24. Gaspar T, Kevers C, Penel C, Greppin H, Reid DM, Thorpe TA (1996), “Plant hormones and plant growth regulation in plant tissue culture”, In vitro cell. Dev. Boil. Plant, 32, pp 272-289.
25. Gatineau F, Fouche JG, Kevers C, Hausman JF, Gaspar T (1977), “Quantitative variations root formation in derooted Pinus halepensis
shoot hypocotyls”, Can. J. Bot., 68, pp 1265-1270.
26. Hobbie SE, Ogdahl M, Chorover J, Chadwick OA, Oleksyn J, Zytkowiak R, Reich PB (2007), “Tree species effects on soil organic matter dynamics: the role of soil cation composition”, Ecosystems, 10, pp 999-1018.
27. Humphries EC (1960), “Inhibition of root development on pertioles and hypocotyls of dwarf bean (Phaseolus vulgaris) by kinetin”, Physiol. Plant, 13, pp 659-663.
28. Kadota M, Niimi Y (2004), “Influences of carbon sources and their concentrations on shoot proliferation and rooting of ‘Hosui’ Japanese pear”, hortscience, 39(7), pp 1681-1683.
29. Kumazawa Y, Mizunoe K, Otsuka Y (1982), “Immunostimulating polysaccharide separated from hot water extract of Angelica acutiloba
Kitagawa (Yamato Tohki)”, Immunology, 47, pp 75-81.
30. Kuroha T, Kato H, Asami T, Yoshida S, Kamada H, Satoh S (2002), “A trans- zeatin riboside in root xylem sp negatively regulates adventitious root formation on cucumber hypocotyls”, J. Exp. Bot., 53, pp 2193-2200. 31. Kuroha T, Ueguchi C, Sakakibara H, Satoh S (2006), “Cytokinin receptors are
required for normal development of auxin-transporting vascular tissues in the hypocotyls but not in adventitious roots”, Plant cell physiol., 47, pp 234-243.
32. Lay HL, “Studies on the production and the improvement in quality of
Angelica Acutiloba Kitagawa”, National Pingtung University of Science and Technology, pp 170-178.
33. Lüdwig-Muller J, Vertocnik A, Town CD (2005), “Analysis of indole-3- butyric acid-induced adventitious root formation on Arabidopsis stem segments”, J. Exp. Bot., 56, pp 2095-2105.
34. Marino G, Magnanini E, Battistini S, Righetti B (1991), “Effect of hormones and main carbon enegy sources on in vitro propagation of apricot (Prunus armeniaca L.)”, Acta Hort., 293, pp 355-362.
35. Marino G, Bertazza G, Magnanini E, Altan AD (1993), “Comparative effects of sorbitol and sucroses as main carbon energy sources in micropropagation of apricot”, Plant cell tiss. Org. Cult., 34, pp 235-244.