quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro
2.2.1.1. Thí nghiệm 1a: Mẫu cấy phiến lá
Vật liệu
Mẫu cấy xuất phát từ chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS có bổ sung 30 g l-1
sucrose. Mỗi mẫu là 1 phiến lá (lá thứ 2 hoặc thứ 3 tính từ chồi ngọn xuống) được cắt thành 3 phần, rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương trên mỗi phần (Hình 2.1). Mẫu cấy phiến lá có trọng lượng tươi trung bình là 124,75 + 20 mg.
Hình 2.1. Chồi và mẫu cấy phiến lá ban đầu Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm có 2 yếu tố:
- Yếu tố A là auxin, có 8 mức độ: NAA 2, 4, 6 hoặc 8 mg l-1
hoặc IBA 2, 4, 6 hoặc 8 mg l-1
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm1a Số TT Nghiệm thứcx Auxin Cytokinin NAA mg l-1 IBA mg l-1 Kinetin mg l-1 1 N8K0 8 0 0 2 N8K1 8 0 1 3 N6K0 6 0 0 4 N6K1 6 0 1 5 N4K0 4 0 0 6 N4K1 4 0 1 7 N2K0 2 0 0 8 N2K1 2 0 1 9 I8K0 0 8 0 10 I8K1 0 8 1 11 I6K0 0 6 0 12 I6K1 0 6 1 13 I4K0 0 4 0 14 I4K1 0 4 1 15 I2K0 0 2 0 16 I2K1 0 2 1
Ghi chú: xN hoặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện cho nồng độ (2,
4, 6 hoặc 8 mg l-1), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l-1
) Điều kiện thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1 sucrose, 8 g l-1 agar. Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121 o
C, 1 atm trong thời gian 20 phút.
- Bình nuôi cấy dạng nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường.
- Thí nghiệm có 16 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 bình, được lặp lại 3 lần, mỗi bình chứa 1 mẫu cấy là 1 phiến lá. Tổng số mẫu cấy là 144 mẫu.
- Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 oC, độ ẩm 65 + 5 % - Thời gian thí nghiệm: 42 ngày.
Hình 2.2. Mẫu cấy phiến lá trong bình Chỉ tiêu theo dõi
- Tỷ lệ mẫu chết (%)
- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) - Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) - Số rễ/mẫu
- Chiều dài rễ/mẫu (mm) - Trọng lượng tươi mẫu (mg) - Trọng lượng khô mẫu (mg)
2.2.1.2. Thí nghiệm 1b: Mẫu cấy cuống lá
Vật liệu
Mẫu cấy xuất phát từ chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g l-1. Mỗi mẫu là 1 cuống lá (lá thứ 2 hoặc thứ 3 tính từ chồi ngọn xuống) được cắt thành 3 phần, rạch tạo 6 vết thương trên mỗi phần (Hình 2.3). Mẫu cấy cuống lá có trọng lượng tươi trung bình là 41,63 + 10 mg.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm có 2 yếu tố:
- Yếu tố A: Có 8 mức độ auxin: NAA 2, 4, 6 hoặc 8 mg l-1
hoặc IBA 2, 4, 6 hoặc 8 mg l-1
- Yếu tố B: Có 2 mức độ cytokinin: kinetin 0 hoặc 1 mg l-1 . Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm 1b số TT Nghiệm thứcx Auxin Cytokinin NAA mg l-1 IBA mg l-1 Kinetin mg l-1 1 N8K0 8 0 0 2 N8K1 8 0 1 3 N6K0 6 0 0 4 N6K1 6 0 1 5 N4K0 4 0 0 6 N4K1 4 0 1 7 N2K0 2 0 0 8 N2K1 2 0 1 9 I8K0 0 8 0 10 I8K1 0 8 1 11 I6K0 0 6 0 12 I6K1 0 6 1 13 I4K0 0 4 0 14 I4K1 0 4 1 15 I2K0 0 2 0 16 I2K1 0 2 1
Ghi chú: xN hoặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện cho nồng độ (2, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4, 6 hoặc 8 mg l-1), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l-1
) Điều kiện thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1 sucrose, 8 g l-1 agar. Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121 o
C, 1 atm trong thời gian 20 phút.
- Bình nuôi cấy dạng chai nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường.
- Thí nghiệm có 16 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 bình, được lặp lại 3 lần, mỗi bình chứa 1 mẫu cấy là 1 cuống lá. Tổng số mẫu cấy là 144 mẫu.
- Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 oC, độ ẩm 65 + 5 % - Thời gian thí nghiệm: 42 ngày.
Hình 2.4. Mẫu cấy cuống lá trong bình Chỉ tiêu theo dõi
- Tỷ lệ mẫu chết (%)
- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) - Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) - Số rễ/mẫu
- Chiều dài rễ/mẫu (mm) - Trọng lượng tươi mẫu (mg) - Trọng lượng khô mẫu (mg)