Áp dụng quy trình đã thẩm định, tiến hành phân tích trên 30 mẫu thức ăn hỗn hợp cho gà được chọn ngẫu nhiên tại công ty Vinacert.
Kết quả phân tích được đánh giá bằng cách so sánh với quy chuẩn QCVN 01-10:2009/BNNPTNT (hàm lượng aflatoxin B1 không vượt quá 10 ppb và hàm lượng tổng các aflatoxins không vượt quá 30 ppb).
Quy trình chung phân tích 30 mẫu thức ăn hỗn hợp cho gà được tiến hành như Hình 3.5.
45
Hình 3.5 Quy trình phân tích mẫu Thêm 20 mL MeOH:H2O (4:1) vào mẫu
Vortex 5 phút Lắc 30 phút (Tốc độc rung lắc 250 vòng/phút) Ly tâm 5 phút, tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ cài đặt 25o C Lọc lấy dịch lọc, hút lấy 10 mL đem tiến hành chiết pha rắn Hoạt hóa cột SPE bằng 5 mL MeOH Rửa bỏ MeOH thừa bằng 3-5 mL H2O
Cho 10 mL mẫu qua cột (loading sample) Rửa cột bằng 0,5 mL MeOH:H2O (4:1),
rửa tiếp bằng 0,5 mL MeOH
Rửa giải bằng 5 mL acetone:H2O:FA (96:3,7:0,3)
Thổi khô bằng hệ thống thổi khí, định mức lại bằng 1 mL H2O:ACN (4:1) Cân 1 gam mẫu đã xay cho vào ống ly tâm 50 mL
Lọc qua màng lọc 0,2 μm vào vial, đem phân tích bằng LC-MS/MS
46
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS
4.1
4.1.1Tối ưu hóa điều kiện chạy máy HPLC
Kết quả chạy HPLC-MS/MS theo 3 phương pháp đã nêu thu được theo thứ tự Hình 4.1, Hình 4.2 và Hình 4.3.
47
48
49
50 Nhận xét:
Dựa vào sắc ký đồ của 3 phương pháp thì phương pháp 1 thể hiện sự tách tốt nhất, các chất AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 xuất hiện với thời gian lưu tách biệt rõ rệt, tiếp theo là phương pháp 3 và phương pháp 2 tách kém nhất.
Phương pháp 2 cho sắc ký đồ với tín hiệu peak bị nhiễu, peak quá tù (AFB1 và AFB2) và bị chẻ ngọn (AFG1). Trong khi đó phương pháp 1 và phương pháp 3 cho tín hiệu peak rõ ràng và nhọn hơn. ở phương pháp 1 có một tín hiệu peak của AFG2 bị tù hơn so với phương pháp 3 nên từ đó kết luận phương pháp 3 cho tín hiệu peak tốt nhất. Mặt khác nếu xét về pha động thì phương pháp 1 sử dụng 0,4% acid acetic trong nước và 0,4% acid acetic trong ACN, trong khi đó phương pháp 3 chỉ sử dụng nước và ACN.
Từ kết quả trên nên quyết định chọn phương pháp 3 làm phương pháp tối ưu cho hệ thống HPLC-MS/MS.
Các thông số đã được cài đặt để tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS theo phương pháp 3 được thể hiện như sau:
Bảng 4.1 Thành phần và tỉ lệ pha động
Thời gian (phút) Pha động A H2O (%) Pha động B ACN (%) 0 90 10 2 90 10 6 25 75 7 90 10 9 90 10 - Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút; - Nhiệt độ cột: 35°C; - Thể tích tiêm 10 μL.
