Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)) là thiết bị phân tích hiện đại, giúp quá trình phân tích nhanh chóng và chính xác trên nhiều nền mẫu khác nhau.
Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC – MS/MS) dựa trên việc sử dụng cột với kích thước hạt siêu nhỏ, có thể tách sắc ký rất tốt thông qua hệ thống áp suất cao (có thể lên đến 1000 atm). Hệ thống áp suất cao được tạo bằng máy bơm có độ chính xác cao kết nối với hệ thống ống nối chịu được áp suất cao của chất lỏng. Điều này cải thiện độ phân giải peak, độ nhạy, cũng như tốc độ phân tích.
30
HPLC – MS/MS là thiết bị được phát triển từ ứng dụng của hệ thống HPLC. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ cho phép phân tích các hợp chất với hàm lượng cực nhỏ (ppb), độ nhạy và độ chính xác cao.
2.3.2.1 Thành phần a. Bơm cao áp
Gồm 2 bơm, 6 kênh kết nối với 6 hệ dung môi khác nhau tiện cho việc phân tích nhiều chỉ tiêu, cũng như rửa hệ thống trong quá trình phân tích.
Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký và rửa giải chất tan khỏi cột sắc ký, bơm được điều chỉnh từ 0-15000 psi (1020 atm) để tạo ra những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc ký.
b. Buồng tiêm mẫu
Gồm có thiết bị định vị ba chiều Oxyz giúp định vị, bơm, hút mẫu từ khay đựng mẫu theo chế độ autopsamler.
Khay đựng mẫu gồm 2 khay, mỗi khay có thể chứa 48 vial chất phân tích.
c. Cột tách
Là cột chứa pha tĩnh, bên trong có chứa chất hấp phụ với kích thước hạt xác định, dùng để tách chất cần phân tích ra khỏi hỗn hợp mẫu và xác định hàm lượng của chất đó. Trong HPLC có thể phân tích nhiều chất cùng lúc dựa vào khả năng tách từng chất tương ứng với thời gian lưu khác nhau.
d. Đầu dò
Trong HPLC có thể được ghép với các thiết bị đầu dò như UV-Vis (ultraviolet-visible), FLD (fluorescence detector), MS (mass spectrometry), MS/MS (tandem mass spectrometry).
Hiện nay đầu dò MS/MS là thiết bị có độ nhạy cao nhất dùng trong phân tích vi lượng.
Một số phương pháp nghiên cứu định lượng aflatoxins
2.4
2.4.1Các phương pháp xác định bằng HPLC [8], [9], [10]
Nhóm nghiên cứu của Hilal Colak (Istanbul University Faculty of Veterinary Medicine, Department of Food Hygiene and Technology, Turkey,
31
2006) đã xác định aflatoxin trong các loại tiêu hạt bằng phương pháp HPLC và ELISA. Phương pháp HPLC được thực hiện như sau:
- Cân 50 gam mẫu với 5 gam NaCl trộn chung, được chiết bằng hệ dung môi methanol:nước (80:20) trong một máy xay tốc độ cao trong 3 phút, lọc bằng giấy lọc. Lấy 10 mL dịch lọc pha loãng với 60 mL dung dịch đệm PBS, lấy 66 mL dung dịch này cho qua cột hấp phụ miễn dịch (immunoaffinity column), cột được hoạt hóa bằng 10 mL PBS, tốc độ qua cột khoảng 3 mL/phút. Sau khi cho mẫu qua cột xong, rửa bằng 15 mL nước. Aflatoxins được rửa giải bằng 1,25 mL methanol, sau đó được định mức bằng 1,75 mL nước.
- Thể tích tiêm 100 μL.
- Bước sóng kích thích và bước sóng phát được thiết lập tại 333 nm và 460 nm.
- Cột C18, kích thước hạt 5 μm, 250 mm x 4.6 mm. - Pha động: acetonitril:nước:methanol (17:54:29). - Tốc độ dòng 1 mL/phút.
- Nhận xét: giới hạn phát hiện của phương pháp là 20 ppb vẫn là khá cao, giá trị R2 của afaltoxin B1 là 0,999, tuy nhiên R2 tổng aflatoxins nhỏ hơn 0,99.
Nhóm nghiên cứu của Anna Chiara Manetta, (Department of Food and Feed Science, University of Teramo, Italy, 2005) đã tiến hành xác định aflatoxin M1 trong sữa và phô mai. Quy trình như sau:
- Đối với sữa: một mẫu sữa được đồng nhất và ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó hút 10 mL của phần nước pha loãng với cung lượng thể tích dung dịch nước đã khử ion (loại ion từ cột SPE). Cột SPE được hoạt hóa bằng 5 mL acetonitril và 10 mL nước khử ion, cho mẫu qua và rửa bằng 10 mL nước, 20 mL acetonitril:nước (20:80) và 10 mL n-henxane. AFM1 được rửa giải bằng 6 mL dichloromethane:acetone (95:5). Sau đó được thổi khô bằng khí nitơ và được định mức lại bằng 200 μL acetonitril, đem phân tích bằng HPLC với mũi tiêm khoảng 10 μL.
- Pha động là acid acetic:acetonitril:2-propanol:nước (2:10:10:78). - Tốc độ dòng 1,2 mL/phút.
- Nhận xét: Phương pháp đơn giản dễ thực hiện, độ thu hồi cao (90%), giá trị SD = 2%, độ lệch chuẩn tương đối thấp từ 2,5 – 4%.
32
Nhóm nghiên cứu của Yan – Yun Hu (Department of Chemistry, University of Science and Technology of China, 2006) đã định lượng aflatoxins trong các mặt hàng nông sản như ớt, đậu xanh, mè đen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD). Kết quả độ thu hồi của các aflatoxins dao động từ 88% đến 95%, với các giá trị RSD nhỏ hơn 6% (n=6). Các giới hạn phát hiện (LOD) là 0,25 ppb với AFB1 và AFG1, 0,1 ppb với AFB2 và AFG2. Phương pháp được đánh giá là đơn giản, nhanh chóng và độ tin cậy tương đối cao.