3.5.3.1 Thí nghiệm về độ tuyến tính
a. Mục đích, yêu cầu
Khảo sát tính tuyến tính của quy trình ở các nồng độ 0,75; 1,5; 3; 4,5; 6 ppb.
Xác định phương trình hồi quy y = ax + b, hệ số tương quan r giữa nồng độ chuẩn/nồng độ nội chuẩn và diện tích peak chuẩn/diện tích peak nội chuẩn.
Yêu cầu: r2
> 0,99.
b. Cách tiến hành
Từ dung dịch chuẩn aflatoxins 300 ppb, tiến hành pha thành các dung dịch của dãy chuẩn từ 0,75 đến 6 ppb.
- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb:
Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 900 μL dung dịch H2O:ACN (4:1) cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác
Hoạt hóa cột SPE bằng 5 mL MeOH Rửa bỏ MeOH thừa bằng 3-5 mL H2O
Cho 10 mL mẫu qua cột (loading sample)
Rửa cột bằng 0,5 mL MeOH:H2O (4:1) Rửa tiếp bằng 0,5 mL MeOH
40
100 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 300 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãn và vortex 1 phút.
- Pha dung dịch chuẩn 3 aflatoxins ppb:
Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 900 μL dung dịch H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác 100 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãn và vortex 1 phút.
- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 4,5 ppb:
Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 850 μL dung dịch H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác 150 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãn và vortex 1 phút.
- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 6 ppb:
Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 800 μL dung dịch H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác 200 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãn và vortex 1 phút.
- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 1,5 ppb:
Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 950 μL dung dịch H2O:ACN (4:1) cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác 50 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãn và vortex 1 phút.
- Pha dung dịch chuẩn 0,75 ppb:
Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 975 μL dung dịch H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác 25 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãn và vortex 1 phút.
Các dung dịch chuẩn pha xong đem tiến hành đo bằng máy HPLC- MS/MS.
3.5.3.2 Thí nghiệm về độ đúng
41
Xác định độ đúng của phương pháp thông qua việc so sánh giá trị tìm được và giá trị thực ở nồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb và 5 ppb.
Tiến hành phân tích mỗi nồng độ 6 mẫu. Độ thu hồi mỗi mẫu phải nằm trong khoảng từ 80-110%.
b. Cách tiến hành
Lượng mẫu tối thiểu để phân tích là 200g, được xay nhuyễn , cho vào túi PE để bảo quản, ép cho không khí thoát ra ngoài túi hết để tránh bị ẩm và oxi hóa, để trong thùng chứa mẫu, bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.
Chọn 6 mẫu trắng đã được xay, cân 1 gam mỗi mẫu cho vào mỗi ống ly tâm 50 mL. Vì khảo sát ở 3 mức nồng độ nên 6 mẫu này mỗi mẫu cân 3 lần.
Đối với nồng độ khảo sát là 1,5 ppb, lượng mẫu là 1 gam thì thể tích chuẩn aflatoxins (chuẩn sử dụng là 30 ppb, được pha từ chuẩn 300 ppb như thí nghiệm trên) cần thêm như sau:
𝑉𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑 =𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 𝑋 𝑁ồ𝑛𝑔 độ𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑 𝑁ồ𝑛𝑔 độ𝑠ử 𝑑ụ𝑛𝑔
Trong đó
𝑉𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑: là thể tích cần lấy
𝑁ồ𝑛𝑔 độ𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑: Nồng độ đạt được sau khi thêm chuẩn vào 1 gam mẫu.
𝑁ồ𝑛𝑔 độ𝑠ử 𝑑ụ𝑛𝑔: Nồng độ chuẩn được sử dụng để thêm vào mẫu.
𝑉𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑 =1 (𝑔𝑎𝑚) 𝑋 1,5 (𝑝𝑝𝑏)
30 (𝑝𝑝𝑏) = 50 (𝜇𝐿)
Dùng micropipette 20 – 200 μL hút chính xác 50 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb cho vào 6 mẫu, để yên 15 phút. Thêm vào mỗi ống ly tâm 20 mL MeOH:H2O (4:1), vortex 5 phút, lắc 30 phút (tốc độ 250 vòng/phút) sau đó ly tâm 5 phút (tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ 25o
C), lọc lấy dịch sau ly tâm và hút chính xác 10 mL đem tiến hành chiết pha rắn.
Dung dịch sau rửa giải được làm khô bằng hệ thống thổi khí sau đó hòa tan lại bằng 1 mL dung dịch H2O:ACN (4:1), vortex 1 phút.
Lọc qua màng lọc 0,2 μm vào vial và đem phân tích bằng hệ thống LC- MS/MS.
42
Tiếp tục khảo sát ở nồng độ 2,5 ppb (𝑉𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑= 83 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb) và 5 ppb (𝑉𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑= 167 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb).
3.5.3.3 Thí nghiệm về độ chính xác
a. Mục đích, yêu cầu
Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của quá trình định lượng ở các nồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb, 5 ppb. RSD càng nhỏ, phương pháp càng chính xác.
Theo Commision Decision 2002/657/EC của Cộng đồng Châu Âu (EC), RSD < 10%.
b. Cách tiến hành
Chọn 6 mẫu trắng đã được xay, cân 1 gam mỗi mẫu cho vào mỗi ống ly tâm 50 mL. Đối với nồng độ khảo sát là 1,5 ppb, hút chính xác 50 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb cho vào 6 mẫu, để yên 15 phút. Thêm vào mỗi ống ly tâm 20 mL MeOH:H2O (4:1), vortex 5 phút, lắc 30 phút (tốc độ 250 vòng/phút) sau đó ly tâm 5 phút (tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ 25oC), lọc lấy dịch sau ly tâm và hút chính xác 10 mL đem tiến hành chiết pha rắn.
Dung dịch sau rửa giải được làm khô bằng hệ thống thổi khí sau đó hòa tan lại bằng 1 mL dung dịch H2O:ACN (4:1), vortex 1 phút.
Lọc qua màng lọc 0,2 μm vào vial và đem phân tích bằng hệ thống LC- MS/MS.
Tiếp tục khảo sát ở nồng độ 2,5 ppb (𝑉𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑= 83 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb) và 5 ppb (𝑉𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑= 167 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb).
3.5.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD)
a. Mục đích
Xác định các giá trị (LOD) đối với mỗi chất nhóm aflatoxins.
b. Cách xác định
Có hai phương pháp xác định giới hạn phát hiện:
Phương pháp không dụng cụ:
Tiến hành xác định giá trị LOD của phương pháp bằng cách pha loãng nồng độ aflatoxin chuẩn đã biết sau đó giảm dần bằng nồng độ pha loãng ½ cho tới khi đạt tới mức tối thiểu nào đó còn phát hiện được bằng quy trình đề xuất.
43
Phương pháp dụng cụ:
- Có thể tiến hành xác định bằng cách xác định phương trình hồi quy y = ax + b.
𝐿𝑂𝐷 = 3,3𝑆𝐷
𝑎
với a: độ dốc của đường tuyến tính.
SD: độ lệch chuẩn của kết quả đo chất phân tích.
- Đo tín hiệu thu được từ chuẩn là S (signal), tín hiệu nhiễu là N (noise), tính toán giá trị S/N (chiều cao peak chất phân tích/nhiễu đường nền). LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3.
Hình 3.4 Cách tính giá trị S/N
Trong quy trình thẩm định này sử dụng phương pháp tính giá trị S/N. Tiến hành xác định giá trị LOD của phương pháp bằng cách: Thử lần lượt các nồng độ 0,2 ppb, 0,5 ppb, 1 ppb, 2 ppb thêm vào mỗi mẫu có khối lượng 1 gam, thực hiện giống như quy trình xử lý mẫu. Đo giá trị S/N ở nồng độ nào nằm trong khoảng 2-3 thì lấy nồng độ đó làm giá trị LOD, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.
3.5.3.5 Giới hạn định lượng (LOQ)
a. Mục đích
Xác định các giá trị LOQ đối với mỗi chất nhóm aflatoxins.
b. Cách tiến hành
Xác định giá trị LOD từ phương pháp trên sau đó tính giá trị LOQ = 3LOD.
44