HMF trong sữa được sinh ra chủ yếu do phản ứng Maillard và một phần cũng do sự caramen hĩa (nếu cĩ). Vì vậy, các tác nhân ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của phản ứng Maillard cũng ảnh hưởng đến hàm lượng HMF được sinh ra.
2.3.1.1 Đường và acid amin
Theo tác giả Kretovic, cường độ của phản ứng phụ thuộc vào bản chất của đường khử. Glucose phản ứng mãnh liệt hơn cả. Sau đĩ là galactose và lactose.
Khả năng tham gia phản ứng của acid amin phụ thuộc vào độ dài của mạch cacbon và vị trí của nhĩm amin so với nhĩm cacboxyl. Nhĩm amin càng xa nhĩm cacbonyl thì tham gia phản ứng càng mạnh; α – acidamin hoạt động kém hơn β – acidamin.
Ngồi ra, tỷ lệ acid amin và đường cũng ảnh hưởng đến cường độ phản ứng. Tỷ lệ giữa acid amin và đường thích hợp nhất là 1/2 hoặc 1/3. Tuy nhiên phản ứng vẫn cĩ thể xảy ra ngay cả khi nồng độ acid amin khơng đáng kể và tỉ lệ giữa acid amin và đường cĩ thể đạt tỉ lệ 1/40, thậm chí là 1/300.
2.3.1.2 Nước
Để phản ứng Maillard tiến hành cực đại thì xung quanh mỗi phân tử protein phải tạo nên lớp đơn phân glucose và lớp đơn phân nước. Như vậy, sự cĩ mặt của nước là điều kiện rất cần thiết để tiến hành phản ứng. Nồng độ chất tác dụng càng cao, lượng nước càng ít thì phản ứng xảy ra càng mạnh.
2.3.1.3 Nhiệt độ và pH
Ở 0oC và dưới 0oC, phản ứng hầu như khơng xảy ra. Từ 95 – 100oC, phản ứng sẽ cho các sản phẩm cĩ cảm quan tốt (màu sậm, mùi khét và vị đắng).
Phản ứng Maillard cĩ thể tiến hành trong một khoảng pH khá rộng. Tuy nhiên trong mơi trường kiềm phản ứng xảy ra nhanh hơn. Trong mơi trường axit pH < 3, phản ứng xảy ra rất yếu và chủ yếu là sự phân hủy đường nhưng khi tăng nhiệt độ tốc độ phản ứng tăng nhanh ngay cả trong mơi trường axit (pH = 2).
2.3.1.4 Thời gian bảo quản sữa
Trong quá trình bảo quản sữa, dù ở nhiệt độ thấp hay nhiệt độ mơi trường thì phản ứng tạo HMF vẫn xảy ra dù rất chậm do acid amin và đường sẵn cĩ trong sữa. Thời gian bảo quản càng lâu, HMF được sinh ra càng nhiều.
2.3.1.5 Chất kìm hãm và chất tăng tốc độ phản ứng
Phản ứng Maillard phụ thuộc vào nhĩm cacbonyl của acid amin. Do đĩ, chất kìm hãm phản ứng là các chất phản ứng được với nhĩm cacbonyl như dimedon, hydroxylamin, bisunfit.
Các chất tăng tốc phản ứng là acid lactic và photphat. Muối của acid lactic và dung dịch đệm photphat làm tăng tốc độ phản ứng rất mạnh.
(Lê Ngọc Tú, 2004)
Ngồi ra, sự cĩ mặt của các ion kim loại như Mg, Mn, Fe (II), Zn cũng ảnh hưởng đến hàm lượng HMF trong sữa. Khi hàm lượng các ion này tăng lên thì hàm lượng của HMF cũng tăng lên tương ứng, đặc biệt là ở nhiệt độ cao.
2.3.2 Các phương pháp xác định HMF trong sữa
2.3.2.1 Xác định HMF bằng phương pháp quang phổ của WHITE (1979)
Phương pháp này dựa trên sự hấp thu cực đại tia cực tím của HMF ở bước sĩng 284 nm.
Hình 2.5: Xác định quang phổ cực đại của HMF (Nguồn: http://hera.ugr.es/doi/15007182.pdf)
2.3.2.2 Xác định HMF bằng phương pháp KEENEY và BASSETTE
Phương pháp này dựa trên sự tạo phức của HMF với acid thiobarbituric (TBA). Hợp chất phức được tạo thành từ HMF và acid thiobarbituric cĩ độ hấp thu cực đại ở bước sĩng 443nm. Sau khi đo được độ hấp thu của phức, ta cĩ thể tính ra nồng độ HMF dựa vào cơng thức (I)
Nồng độ HMF (µmol/l sữa) = (Độ hấp thụ - 0,055)*87.5 (I) (Nguồn: Lab of Food technology. KU. Leuven)
Hình 2.6: Sự tạo phức giữa HMF và acid thiobarbituric
(Nguồn: http://www.if.csic.es/proyectos/cost927/COST927-TS-HMF-FJM.pdf)
2.3.2.3 Xác định HMF bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Đây là một phương pháp hiện đại trong việc phân tích hàm lượng HMF cĩ trong sữa cũng như trong các thực phẩm khác và cĩ độ chính xác cao hơn so với các phương pháp khác. Tuy nhiên, thiết bị này khá đắt tiền và do khơng cĩ điều kiện sử dụng nên chúng tơi tiến hành khảo sát hàm lượng HMF trong sữa bị tươi theo phương pháp so màu của KEENEY & BASSETTE bằng máy đo quang phổ UV – Visible ở bước sĩng 443 nm.
2.4 Xác định hằng số tốc độ phản ứng và năng lượng hoạt hĩa
2.4.1 Hằng số tốc độ phản ứng
Hằng số tốc độ phản ứng của một phản ứng là đại lượng đặc trưng cho bậc của phản ứng. Hằng số tốc độ phản ứng cĩ thể được xác định bằng phương pháp gián đoạn hoặc liên tục.
a) Phương pháp gián đoạn
Tiến hành thí nghiệm trong những khoảng thời gian xác định, lấy mẫu và định phân lượng tác chất (hoặc sản phẩm) cịn lại.
HMF
TBA
b) Phương pháp liên tục
Người ta theo dõi vận tốc phản ứng ở tất cả các thời điểm bằng một trong những phương pháp sau:
- Quang học: hỗn hợp hĩa chất được đặt trong một ống cĩ bề dày xác định và ống này được đặt trong hệ thống điều nhiệt thích hợp tùy loại dụng cụ sử dụng để đo sự giảm nồng độ của tác chất hay sự gia tăng của sản phẩm theo thời gian bằng cách đo sự hấp thụ ở một bước sĩng nhất định.
- Dùng triền quang kế: cho những trường hợp hỗn hợp của các chất trong phản ứng cĩ tính triền quang.
- Ngồi ra cịn cĩ thể theo dõi phản ứng bằng pH kế, máy đo độ dẫn điện. Từ kết quả thí nghiệm trên ta xác định được hằng số tốc độ phản ứng.
2.4.2 Năng lượng hoạt hĩa
Giả sử ta cĩ phản ứng: A + B C + D
Sự thực hiện phản ứng A và B buộc phải cĩ sự đứt nối trong tác chất và sự ráp nối để tạo thành sản phẩm C và D.
Muốn cĩ sự đứt nối đĩ, cần phải cĩ một năng lượng tác kích vào các phân tử, làm cho các phân tử va chạm cĩ thể thắng được lực đẩy giữa các lớp vỏ electron khi chúng tiến gần nhau và nhờ đĩ xảy ra sự phá hủy liên kết cũ, phân bố mật độ electron và hình thành liên kết hĩa học mới. Năng lượng tự do tối thiểu mà tác chất cần phải cĩ thêm so với năng lượng đầu tiên để tác chất cĩ thể phản ứng gọi là năng lượng hoạt hĩa Ea.
Vậy năng lượng hoạt hĩa của một chất là năng lượng tối thiểu cần cung cấp cho các tiểu phân tử để chúng trở thành hoạt động và cĩ thể tương tác với nhau. Tổng năng lượng hoạt hĩa của các chất phản ứng sẽ là năng lượng hoạt hĩa của phản ứng.
Hình 2.7: Giản đồ năng lượng hoạt hĩa theo tiến trình phản ứng
Như vậy năng lượng hoạt hĩa là hiệu số của năng lượng tối thiểu cần thiết cho phản ứng để tương tác xảy ra và năng lượng trung bình của các tiểu phân, nghĩa là so với năng lượng ban đầu của hệ phản ứng.
2.4.3 Động học của phản ứng
Theo nhiệt động học (phương trình đẳng áp, đẳng tích hĩa học) cĩ thể biểu diễn sự phụ thuộc của hằng số tốc độ vào nhiệt độ như sau:
2 ln RT E dT k d a (*)
Đây là dạng phương trình vi phân của Arrhenius.
Ea Ea C + D A + B [A…B]+- Tiến trình phản ứng
Từ phương trình (*) ta cĩ thể biến đổi về dạng: dT RT E k d a 2 ln dT RT E k d a 2 ) ln ( 0 0 1 1 ln ln T T R E k k a
Với T0 = Tref; k0 = kref
Hoặc ref a ref T T R E k k ln 1 1 ln Trong đĩ: T: nhiệt độ xử lý (K) K:hằng số tốc độ phản ứng (phút-1) kref: hằng số tốc độ tại Tref (phút-1)
R: hằng số khí lý tưởng (R = 8,314 J/mol.K) Ea: năng lượng hoạt hĩa (kJ/mol)
Hình 2.8: Hình vẽ minh họa ảnh hưởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ phản ứng (Trần Thị Huệ, 2007)
1/T
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện tiến hành thí nghiệm
3.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: 13/02/2012 đến 13/04/2012.
Địa điểm: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Hĩa Học – Khoa Cơng Nghệ - Đại học Cần Thơ và phịng thí nghiệm bộ mơn Chăn nuơi – Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng – Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thiết bị - dụng cụ
Máy đo quang phổ UV – Visible. Bể điều nhiệt.
Cân điện tử. Máy khuấy từ.
Ống nghiệm, cốc thủy tinh, bình tam giác. phễu lọc, pipet, ống đong, nhiệt kế.
3.1.3 Hĩa chất
Acid oxalic 0,3 N
Acid trichloracetic 40% (TCA 40%) Acid thiobarbituric 0,05 N (TBA 0,05 N)
3.1.4 Nguyên liệu
Sữa bị tươi được lấy từ hợp tác xã bị sữa Long Hịa và trại chăn nuơi thực nghiệm của trường đại học Cần Thơ.
3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hồn tồn với 2 nhân tố là thời gian và nhiệt độ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết quả thu nhận được xử lý bằng excel.
3.2.1 Mục đích thí nghiệm
Xác định hằng số tốc độ phản ứng và năng lượng hoạt hĩa trong quá trình sản sinh ra HMF trong sữa bị tươi với hai nhân tố là nhiệt độ và thời gian.
3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm và cách tiến hành
3.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm khảo sát theo sự thay đổi nhiệt độ và thời gian theo các mức: Nhân tố 1: Nhiệt độ
To65: Gia nhiệt sữa ở 65oC. To75: Gia nhiệt sữa ở 75oC. To85: Gia nhiệt sữa ở 85oC. To95: Gia nhiệt sữa ở 95oC. Nhân tố 2: Thời gian gia nhiệt
TG0: Thời gian khởi điểm quan sát. TG15: Thời gian gia nhiệt được 15 phút. TG30: Thời gian gia nhiệt được 30 phút. TG45: Thời gian gia nhiệt được 45 phút. TG60: Thời gian gia nhiệt được 60 phút. TG75: Thời gian gia nhiệt được 75 phút. TG90: Thời gian gia nhiệt được 90 phút. TG105: Thời gian gia nhiệt được 105 phút. Tổng số nghiệm thức: 8x4 = 32
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: To65 To75 To85 To95 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TG0 - - - - TG15 - - - - TG30 - - - - TG45 - - - - TG60 - - - - TG75 - - - - TG90 - - - - TG105 - - - - 3.2.2.2 Cách tiến hành
Cĩ 3 cách để xác định hàm lượng HMF trong sữa là phương pháp quang phổ của White, phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phương pháp so màu của KEENEY & BASSETTE. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp được đánh giá là cĩ độ chính xác cao hơn các phương pháp khác. Tuy nhiên, hiện nay trong phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Hĩa Học – Khoa Cơng Nghệ - Trường Đại học Cần Thơ chưa cĩ thiết bị này, vì vậy phương pháp được áp dụng để khảo sát hàm lượng trong sữa bị tươi trong đề tài này là phương pháp so màu của KEENEY & BASSETTE.
Để xác định hàm lượng HMF trong sữa bị tươi theo phương pháp KEENEY & BASSETTE, ta cần thực hiện các bước sau:
Bước 1: Gia nhiệt sữa tươi.
Cho 4 ml sữa tươi vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid oxalic vào, đậy kín và lắc đều. Đặt vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ cần đo.
Bước 2: Ổn định nhiệt độ thí nghiệm và lưu trữ mẫu theo thời gian thí nghiệm (từ 0 phút đến 105 phút).
Hình 3.1: Mẫu thí nghiệm sau khi đã lưu trữ theo thời gian và nhiệt độ cần thiết
Bước 3: Loại bỏ protein.
Từ nhiệt độ thí nghiệm, mẫu được làm nguội nhanh xuống nhiệt độ phịng. Thêm 2 ml acid trichloracetic 40%.
Hình 3.2: Mẫu thí nghiệm sau khi thêm 2 ml TCA 40%
Lắc đều và để yên vài phút để protein kết tủa hoàn tồn. Lọc lấy phần nước trong của hỗn hợp trên.
Bước 4: Thực hiện phản ứng tạo phức.
Lấy 1,6 ml nước lọc từ hỗn hợp trên cho vào ống nghiệm. Thêm vào 0,4 ml acid thiobarbituric 0,05 N. Đậy kín ống nghiệm và đặt vào bể điều nhiệt ở 40oC trong 40 phút. Sau đĩ, lấy mẫu ra và làm nguội đến nhiệt độ phịng.
Bước 5: Đo độ hấp thụ của phức vừa được tạo thành bằng máy quang phổ UV – Vis ở bước sĩng 443 nm. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ của các lần đo.
Hình 3.3: Máy đo quang phổ UV - Vis
Bước 6: Tính hàm lượng HMF
Từ độ hấp thu của các mẫu phân tích, dựa vào cơng thức sau để tính hàm lượng HMF cĩ trong sữa:
Nồng độ HMF (µmol/l sữa) = (Abs - 0,055)*87.5 (Nguồn: Lab of Food technology. KU. Leuven)
Hàm lượng HMF (mg/kg sữa tươi) = 3
10 * 11 , 126 5 , 87 * ) 055 , 0 ( d Abs
Abs: độ hấp thụ của HMF ghi nhận được. d: tỷ trọng của sữa tươi.
3.3 Các thơng số cần xác định
Hàm lượng HMF cĩ trong sữa bị tươi. Hằng số tốc độ phản ứng K.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.1 Thành phần dưỡng chất trong sữa bị tươi
Sữa bị tươi chứa rất nhiều dưỡng chất cần thiết cho sự phát triển của con người. Trong đĩ, thành phần dưỡng chất chủ yếu tạo ra năng lượng cung cấp cho cơ thể con người là đạm, đường và béo trong sữa. Tùy vào thành phần thức ăn cung cấp cho bị, giống bị và lứa tuổi cho sữa của bị mà các thành phần đạm, đường và béo cĩ sự thay đổi về tỉ lệ trong sữa. Sự hình thành HMF trong sữa bị tươi chịu tác động trực tiếp của hai thành phần dưỡng chất cĩ trong sữa là đạm sữa và đường sữa (đường lactose). Vì vậy, cần xác định hàm lượng thành phần các dưỡng chất trong sữa bị tươi để xác định các nguyên nhân ảnh hưởng đến quá trình sinh ra HMF.
Nguyên liệu sữa bị tươi dùng trong thí nghiệm được thu thập từ trại chăn nuơi thực nghiệm của trường Đại học Cần Thơ và hợp tác xã bị sữa Long Hịa. Các mẫu sữa được gia nhiệt ở các nhiệt độ 65oC, 75oC, 85oC và 95oC trong các khoảng thời gian 30, 60 và 90 phút. Các mẫu sữa sau khi gia nhiệt sẽ được đem phân tích thành phần dưỡng chất bằng máy Milkoscope, model: Julie C3 Automatic.
4.1.1 Mẫu sữa ở trại chăn nuơi thực nghiệm trường Đại học Cần Thơ
Bảng 4.1: Hàm lượng chất béo (Fat) tính theo % trong sữa bị tươi
30 phút 60 phút 90 phút
65oC 2,56 3,60 3,47
75oC 3,08 3,25 3,4
85oC 3,42 3,28 3,48
95oC 3,54 3,49 3,19
Hình 4.1: Hàm lượng chất béo cĩ trong sữa bị tươi biến đổi trong quá trình gia nhiệt
Dựa vào kết quả thu được từ bảng 4.1 và hình 4.1, ta cĩ thể thấy hàm lượng chất béo trong sữa bị tươi khi được gia nhiệt trong vịng 30 phút đầu cĩ xu hướng tăng lên, từ 2,46% lên 3,47% khi nâng từ nhiệt độ 65oC lên 95oC. Trong khi đĩ, khi gia nhiệt lâu hơn với cùng các mức nhiệt như trên thì hàm lượng chất béo lại cĩ chiều hướng giảm xuống một ít.
Điều này cĩ thể lý giải bởi lượng nước trong sữa khi gia nhiệt càng cao thì sẽ càng bị mất đi nhiều do bốc hơi. Vì vậy, tỷ lệ chất béo trong tổng thể tích sữa tăng lên khi nâng cao nhiệt độ trong 30 phút đầu tiên. Tuy nhiên, thời gian càng dần về sau, khơng chỉ lượng nước bị mất đi mà lượng chất béo trong sữa cũng bị oxy hĩa và mất đi. Do đĩ, tỷ lệ chất béo trong sữa cũng vì vậy mà cĩ dấu hiệu giảm xuống.
2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8
65oC 75oC 85oC 95oC
Nhiệt độ T ỷ l ệ b é o ( % ) F (%) 30 phút F (%) 60 phút F (%) 90 phút
Bảng 4.2: Hàm lượng chất đường (Lactose) tính theo % trong sữa bị tươi 30 phút 60 phút 90 phút 65oC 5,15 5,15 5,27 75oC 5,12 5,20 5,32 85oC 5,14 5,14 5,41 95oC 5,28 5,46 5,62
Hình 4.2: Hàm lượng đường cĩ trong sữa bị tươi biến đổi trong quá trình gia nhiệt
Từ các thơng số trong bảng 4.2 và hình 4.2, ta cĩ thể thấy tỷ lệ đường lactose trong sữa tăng dần theo thời gian gia nhiệt và nhiệt độ. Vì lượng nước bị mất đi do bốc hơi nên lượng đường lactose trong tổng thể tích sữa tăng lên theo thời gian và nhiệt độ gia nhiệt. Khi thời gian gia nhiệt càng lâu, lượng nước mất đi càng nhiều,