- IFAP: 5’ CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC3’ EAP : 5’AGTGCTTTACAGCCCGC3’
3.1.Tách chiết ADN
3. Nghiên cứu quy trình sử dụng chỉ thị phân tử phục vụ cho chọn cáthể và dòng thuần mang gen thơm
3.1.Tách chiết ADN
Do đối tượng nghiên cứu của cây lúa rất khác nhau, đó có thể là các dòng, giống với số lượng lớn về quần thể, nhưng đó cũng có thể là các tổ hợp lai F1, chỉ là 1 cá thể. Nên đểđảm bảo về sức sống và sinh trưởng cho đối tượng được nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu quy trình chiết tách ADN tối ưu trên lá non (7 ngày tuổi), lá bánh tẻ (25-30 ngày tuổi), và lá thu được từ nhánh chét.
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu để lựa chọn ra phương pháp tốt nhất để tách chiết ADN trên từng loại lá kể trên. Có nhiều phương pháp chiết tách ADN khác nhau, song chúng tôi đã lựa chọn nghiện cứu trên 3 phương pháp phổ biến nhất đó là: Phương pháp của IRRI có cải tiến; phương pháp của Zheng và cộng sự đã được cải tiến và phương pháp NaOH biến đổi.
- Phương pháp1: Chiết tách DNA của IRRI :
Quy trình chiết tách này đã trở thành phương pháp tiêu chuẩn đánh giá PCR trong chọn tạo giống ở IRRI. Dung dịch đệm tách chiết bao gồm: 500mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM EDTA pH 8.0, 300mM NaCl, SDS 8%, Pha các nồng độ gốc với 1M Tris-HCl pH 8.0, 0,5M EDTA pH 8.0, 5M NaCl, 2,5M Potassium acetate pH 5,0, 3,0M Sodium acetate, Ethanol 80%, Rnase, TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, H2O). Các dung dịch có thểđược bảo quản ở nhiệt độ phòng sau khi đã hấp khử trùng.
- Phương pháp 2: Theo Zheng và cộng sự (2006):
Phương pháp này sử dụng một số hoá chất có khả năng tẩy mạnh như: phenol, isoamylacohol, chloroform, nên có thể nhanh chóng thu được DNA với độ nguyên vẹn và tinh sạch đủđảm bảo cho PCR. Dung dịch đệm tách chiết tách gồm: 50mM Tris-HCl pH8.0, 0,25mM EDTA pH8,0, 300mM NaCl, SDS 10% và nước siêu sạch.
Đây là phương pháp chiết tách ADN rất nhanh, thuận tiện cho phân tích PCR lượng mẫu nhỏ. Sử dụng phương pháp này một ngày một người có thể chiết tách được khoảng 150 – 200 mẫu. Phương pháp này dùng dung dịch đệm chiết là 0,5M NaOH, 0,1M Tris-HCl pH 8,0, C:I (24:1).