IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4. Tinh sạch và thu nhận IgG
Protein G tinh sạch được gắn với gel Sephadex G25 và bảo quản trong ethanol trước khi tách IgG. Ethanol được rửa giải bằng binding buffer (0,2M Sodium phosphate PH7, 1,73g Na2HPO4, 1,22g NaH2PO4).
Huyết thanh của lợn được gây miễn dịch với Clostridium perfringens
được pha loãng với dung dịch binding buffer (1/50) và lọc qua fin lọc kích thước 0,8µm để loại bỏ cặn.
Lấy 5ml huyết thanh cho chạy qua cột Sephadex G25 – protein G và rửa cột bằng binding buffer cho tới khi dịch thu được dưới cột trong suốt.
IgG được thẩm tách ra khỏi cột bằng dung dịch Elution buffer (1.0M glycine-HCl PH2.7, glycine 7.51g), dịch thẩm tách được thu vào ống 50ml và kết tủa bằng muối amonium sunphate bão hòa ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. IgG được tách bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 độ C và làm tan tủa trong PBS ở 4°C trong 10 giờ.
Sau quá trình tinh sạch hàm lượng IgG tổng số đo được bằng UV vis là 6,7mg/ml.
IgG thu được là kháng thể đa dòng (Pab-polyclonal antibody) kháng
Clostridium perfringens. Đểđánh giá mức độ đặc hiệu, khả năng phát hiện vi khuẩn Clostridium perfringens gây bệnh tiêu chảy ở lợn con sơ sinh, chúng tôi sử dụng phản ứng sanwish Elisa với quy trình và thu được kết quả như sau:
Quy trình:
Bước 1: Phủ giếng bằng kháng thểđa dòng từ lợn kháng Clostridium perfringens
Bước 2: Bổ sung kháng nguyên hòa tan của Clostridium perfringens
Bước 3: Thêm kháng thểđơn dòng từ chuột kháng Clostridium perfringens
Bước 4: Bổ sung kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột đánh dấu bằng alkaline phosphtase
Bước 5: Thêm cơ chất alkaline phosphtase vào giếng, ử trong tối và đo OD ở
bước sóng 405nm.
Chúng tôi sử dụng kháng thể đa dòng để phủ giếng (capture antibody) với mục đích làm tăng độ nhạy của quy trình phát hiện
Clostridium perfringens. Phản ứng ELISA được thiết lập bằng phương pháp checkerboard để tìm ra nồng độ bão hòa của các kháng thể sử dụng bao gồm kháng thể đa dòng phủ giếng, KTĐD “bắt giữ” và kháng thể thứ cấp phát hiện.
Để xác định hàm lượng IgG thu nhận cho phản ứng phát hiện vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở lợn sơ sinh, chúng tôi cố định nồng độ kháng thểđơn dòng là 1,25 µg/ml và độ pha loãng kháng thể thứ cấp (1/1000), thay đổi nồng độ kháng thể đa dòng kháng Clostridium perfringens theo cột và
kháng nguyên Clostridium perfringens theo hàng.
Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, các giếng trong đĩa ELISA 96 giếng có khả năng gắn được khoảng 50 µl dung dịch protein với nồng độ
0,5 - 10 µg/ml nên chúng tôi sử dụng nồng độ kháng thể đa dòng phủ
giếng trong khoảng 2,5-5 µg/ml để tìm nồng độ kháng thể bão hòa, tức là một nồng độ tối thiểu kháng thể phủ giếng cho giá trị OD cao nhất. Chúng tôi khảo sát nồng độ bão hòa của kháng thể đa dòng từ 2,5-5 µg/ml và 3 nồng độ kháng nguyên Clostridium perfringens là 5,0 µg/ml; 2,5 µg/ml và 1,25 µg/ml. Giếng chứng (blank) không bổ sung IgG. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết quả giá trị OD405 trung bình được trình bày trong bảng 2.5.
Bảng 2.5. Giá trị OD với các nồng độ khác nhau của kháng thể đa dòng (Pab) phủ giếng Nồng độ Pab phủ giếng (µg/ml (ODTB - ODBLANK) ± STD Ag 5,0 µg/ml Ag 2,5 µg/ml Ag 1,25 µg/ml 5 1,688 ± 0,173 1,358 ± 0,154 1,060 ± 0,107 4,5 1,754 ± 0,258 1,316 ± 0,141 1,070 ± 0,080 4 1,568 ± 0,189 1,269 ± 0,109 1,051 ± 0,057 3,5 1,410 ± 0,155 1,147 ± 0,077 0,976 ± 0,068 3 1,227 ± 0,162 1,009 ± 0,072 0,863 ± 0,045 2,5 0,902 ± 0,114 0,738 ± 0,075 0,636 ± 0,095
Ag: protein hòa tan của Clostridium perfringens
Kết quả bảng 2.5 cho thấy điểm bão hòa kháng thể đa dòng xuất hiện
ở nồng độ 4,5 µg/ml ở cả 3 nồng độ kháng nguyên Ag khảo sát (5,0 µg/ml; 2,5 µg/ml và 1,25µg/ml). Giá trị STD của 3 lần lặp lại thí nghiệm hơi cao ở nồng độ Ag 5 µg/ml nhưng vẫn nằm trong khoảng chấp nhận được. Như vậy, nồng độ kháng thể đa dòng phủ giếng tối ưu trong thử nghiệm ELISA là 4,5 µg/ml.
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận
• Đã sàng lọc được 7 chủng Streptococcus sp từ 24 chủng vi khuẩn phân lập từ từ các mẫu nội tạng động vật như lợn, gà, cá trên địa bàn thành phố Hà Nội
• Đã tuyển chọn được chủng Streptococcus sp S8.1.1 có khả năng sinh protein G với trọng lượng phân tử 52kDa, có khả năng gắn kết với IgG của 5 loài động vật: gà, lợn, thỏ, bò và chuột. Trong đó, có khả năng gắn kết cao nhất với IgG bò và thấp nhất là IgG gà
• Bước đầu xây dựng được qui trình thu nhận và làm sạch protein G từ
Streptococcus sp S8.1.1
• Đã tinh sạch được kháng thể kháng vi khuẩn Clostridium perfringens, kháng thể này phát hiện đặc hiệu vi khuẩn gây bệnh ở nồng độ 4,5 µg/ml.
2.Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng IgG vào chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn con do vi khuẩn Clostridium perfringens gây nên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (2012) “Phân lập
và xác định đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus agalactiae từ cá điêu hồng (Oreochromis sp) bệnh phù mắt và xuất huyết”
2. GS. TS. Đỗ Ngọc Liên (2007), " Sinh học phân tử mạng tế bào" Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội.
3. Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2002), “Hóa sinh công nghiệp”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
4. Nguyễn Lân Dũng (2005) “Vi sinh vật học”, Nhà xuất bản giáo dục 5. Nguyễn Văn Mùi (2007), “Thực hành hóa sinh học”, Nhà xuất bản
Đại học quốc gia Hà Nội.
6. Phạm Hồng Quân (2013), “Nghiên cứu một sốđặc tính sinh học của vi khuẩn Streptococcus spp. Gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi tại một số tỉnh miền bắc”
7. Vũ Thị Minh Đức (2011), “Thực tập vi sinh vật học”, Nhà xuất bản
Đại học quốc gia Hà Nội
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
8. Barrow G.I and Feltham R.K.A (1993). “Cowan and Steel's manual
for the identification of medical bacteria” Cambridge University Press.
9. Gilman AG (1987), “G proteins; transducers of receptor-generated
signals”. Annu Rev Biochem 56
10. H.F. Jenkinson and RJ Lamont (1997). “Streptococcal Adhesion and
11. Micheal D. Wilcox, Kevin L. Schey et al (1994). “Analysis of G protein gamma subunit heterogeneity using mass spectrometry”
12. Simon MI, Strathmann MP, Gautam N (1991), “Diversity of G
proteins in signal transduction”.
13. Sjobring U, Bjorck L, Kastern W, et al (1991). "Streptococcal protein G. Gene structure and protein binding properties". J Biol Chem 266
14. Woe Yeon Kim, Na Eun Cheong, Dong Chul Lee, Dae Yeop Je,
Jeong Dong Bahk, Moo Je Cho, and Sang Yeol Lee (1995), “Cloning and Sequencing Analysis Encoding a G Protein a Subunit,of a Full-Length cDNA SGA7, from Soybean”
15. Κ Sandhya and Mohan C Vemuri (1997), “Regulation of cellular
signals by Protein Gs”
TÀI LIỆU WEB
16. http://www.tinkhoahoc.com
17. http://vietsciences.free.fr
18. http://vietsciences.net/
19. http://books.google.com.au/
20. http://vi.wikipedia.org/
21. http://www.Vietsciences.org
22. http://d.violet.vn/
23.http://diendanykhoa.com/
