IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2. Kết quả tách chiết và làm sạch protei nG từ 7 chủng Streptococcus sp
Các chủng Streptococcus sp được lên men trong môi trường canh khuẩn BHI sử dụng bình tam giác 250ml với điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ
37oC, nuôi lắc 160 vòng/phút, thời gian lên men 72 giờ. Sau khi lên men, tiến thành thu hồi dịch lên men, ly tâm thu tủa và bổ sung đệm PBS 0,05M, pH=7.
Hình 2.2: Dịch vi khuẩn sau 72 giờ lên men và ly tâm thu tế bào
Nhằm thu hồi protein G trong vách tế bào vi khuẩn, chúng tôi sử dụng phương pháp phá tế bào sử dụng sóng siêu âm với tần số 20Hz. Dịch protein thô thu được sau khi phá vỡ tế bào được pha trong PBS (0,05M, pH 7,0).
protein G được kết tủa bằng theo hai phương pháp: sử dụng dung môi hữu cơ
(aceton) và sử dụng muối ammoni sulfate (NH4)2SO4 bão hoà 60%.
2.1. So sánh hiệu quả kết tủa Protein G bằng aceton và (NH4)2SO4 bão hoà 60%
Dịch chiết protein thô được kết tuả bằng aceton lạnh (-20oC) tỷ lệ
Vdịch:Vaceton=1:1, thời gian kết tủa 60 phút trong điều kiện 4oC, sử dụng khuấy từ, sau đó ly tâm thu tủa. Kết tủa được làm khô bằng cách cho aceton bay hơi tự nhiên trong không khí ở nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung đệm PBS 0,05M, pH=7, giữ trong lạnh 4oC. Protein thu được sẽ được xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford.
Tương tự, dịch chiết protein thô được kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 bão hoà 60%. Sau đó, ly tâm thu kết tủa và loại muối bằng túi bán thấm. Protein sau khi thu được cũng được xác định hàm lượng protein tổng theo phương pháp Bradford. Kết quảđược trình bày trong hình 2.3 và bảng 2.3.
Bảng 2.3: Kết quả dựng đường chuẩn BSA STT BSA 0.1mg/ml (µl) H2O (µl) Dung dịch Bradford (µl) Nồng độ BSA (mg/ml) OD/595nm 1 0 1000 2000 0 0 2 100 900 2000 0.01 0.034 3 200 800 2000 0.02 0.065 4 300 700 2000 0.03 0.089 5 400 600 2000 0.04 0.124 6 500 500 2000 0.05 0.156
Từ bảng kết quả trên lập được đường chuẩn BSA như sau:
Y=3.068X + 0.001, R2 = 0,998.
Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn BSA
Dựa vào đồ thị đường chuẩn (hình 2.4) và công thức (1), chúng tôi tính
được hàm lượng protein tổng số, kết quảđược trình bày tại bảng 2.4
OD
Bảng 2.4: Kết quả thu hồi Protein G theo hai phương pháp kết tủa bằng aceton và (NH4)2SO4 bão hoà 60%
STT Ký hiệu chủng
Tủa bằng Aceton Tủa bằng (NH4)2SO4
OD/595nm X(mg/ml) OD/595nm X(mg/ml) 1 S3.6.1 0.079 0.250 0.023 0.072 2 S4.5.2 0.464 1.509 0.198 0.642 3 S5.4.2 0.350 1.138 0.102 0.329 4 S7.3.1 0.087 0.280 0.043 0.137 5 S8.1.1 0.573 1.864 0.269 0.873 6 S8.2.3 0.036 0.114 0.017 0.052 7 S8.5.2 0.096 0.309 0.048 0.153
Như vậy, kết quả bảng 3.4 cho thấy phương pháp kết tủa protein bằng aceton hiệu quả hơn so với phương pháp kết tủa sử dụng muối amoni sulfate bão hoà 60%, hàm lượng protein thu được khi kết tủa bằng aceton nhiều gấp 1.5-2 lần so với kết tủa bằng muối amoni, do vậy chúng tôi đề xuất lựa chọn phương pháp kết tủa protein G bằng aceton để xây dựng qui trình thu nhận protein G từStreptococcus sp.
Tuy vậy, lượng protein thu được từ các chủng Streptococcussp nghiên cứu tương đối thấp, trong 7 chủng Streptococcus sp, chỉ có chủng
Streptococcus sp S8.1.1 có hàm lượng protein tổng số lớn nhất là 1.864mg/ml, do vậy chúng tôi lựa chọn chủng Streptococcus sp S8.1.1 để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
2.2. Kết quả làm sạch Protein thu nhận từ chủng Streptococcus sp S8.1.1
bằng sắc kí lọc gel
Protein thu nhận từ chủng Streptococcus sp S8.1.1 được làm sạch bằng sắc ký lọc gel, sử dụng gel sephadex G-50 (Amersham, Mỹ). Dịch protein thô thu
được sau khi phá vỡ tế bào được pha trong PBS (0,05M, pH 7,0). Thành phần protein của tế bào vi khuẩn được loại bỏ bằng enzyme trypsin, protein G được kết tủa bằng aceton. Kết tủa được hòa tan trong PBS (0,05M, pH 7,0) và tiến hành tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sử dụng cột Sephadex G-50 (Amersham, Mỹ) thể tích 15 ml, tốc độ chảy 25ml/giờ, thu 20 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Các tiểu phần protein được thu trong mỗi phân đoạn được kiểm tra mức
độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.
Hình 2.5: Hình ảnh điện di protein ở các bước tinh sạch của chủng S8.1.1
(M: Thang chuẩn, giếng 1: phân đoạn 12, giếng 2: phân đoạn 3, giếng 3: phân đoạn 9, giếng 4: phân đoạn 8, giếng 5: phân đoạn 10, giếng 6: phân đoạn 4, giếng 7: phân đoạn 5 )
Theo Alfred G. Gilman (1987), protein G bao gồm 3 tiểu phần α (39-52 kDa), β (35-39kDa), γ (7-10kDa) [11][12]. Trong đó, tiểu phần βγ có cấu trúc rất bền vững và khó bị phân cắt bởi Trypsin (GS.TS Đỗ Ngọc Liên, 2007) [1].
cho thấy, tất cả các mẫu tinh sạch protein từ chủng S8.1.1 đều xuất hiện band khoảng 52 kDa (Hình 2.5). Tuy nhiên, vạch điện di ở phân đoạn 12 ( line 1) có màu nhạt nhất và vạch điện di ở các phân đoạn 4 và 5 (line 6 và 7) có màu
đậm nhất, thể hiện sự thay đổi về hàm lượng protein qua các bước phân đoạn khác nhau. Theo như Alfred G. Gilman (1987), thì các vạch protein này có thể là tiểu phần α (39-52 kDa) của protein G. Để khẳng định chắc chắn hơn nữa protein này là tiểu phần α (39-52 kDa) của protein G, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng lai Western blot giữa protein G với kháng thểđặc hiệu, vị
trí phản ứng giữa protein G với kháng thể đặc hiệu chuẩn tương ứng với vị
trí phản ứng của protein G chuẩn của hãng Sigma, Mỹ và có kích thước khoảng 52 kDa trên thang chuẩn (hình 2.6). Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn chủng S8.1.1 để kiểm tra khả năng gắn kết với kháng thể động vật của protein G.
Hình 2.6: Kết quả phản ứng lai Western blot
Giếng M: Thang chuẩn, giếng 1-7: protein G tách ở các phân đoạn, giếng 8: protein chuẩn của sigma, Mỹ, giếng 9-12: protein G pha loãng ở các nồng độ
15µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml, 2,5 µg/ml