IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3. Phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp Elisa gián tiếp kiểm tra khả năng gắn kết kháng thể
- Mục đích: Kiểm tra khả năng gắn gắn kết kháng thểđộng vật của Protein G - Tiến hành:
Trình tự phản ứng:
Bước 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ
5µg/giếng được gắn trực tiếp vào đĩa ELISA. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở
nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 3. Gắn kháng thể: 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ 1/400 bằng dung dịch PBS – sữa tách bơ 5%. Kháng thểủ trong đĩa ở nhiệt độ 37oC, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài: 100µl goat anti-rabbit IgG HRPO (Sigma) pha loãng 1/10.000 nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ
dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 5 lần, và làm khô.
Bước 4. Cơ chất tạo màu: 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ
phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2¬SO4 1M, lúc này phản ứng có màu vàng. Bước 5. Đọc kết quả trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.
PHẦN II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN