IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3. Phương pháp nghiên cứu
3.2.4. Phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-50
•Mục đích
Thu được các peptide với khối lượng phân tử mong muốn trong đó loại bỏđược tạp và peptide lớn.
•Tiến hành
+ Nhồi cột:
Gel G-50 được làm trương nở ở nhiệt độ phòng trong nước cất khoảng 3 giờ. Cột sắc ký được rửa sạch. Cho khoảng 2-3 mL nước cất vào trước. Tiếp theo cho gel vào theo dòng liên tục. Khi cho hết thể tích gel, đợi cột ổn định ở
áp suất tĩnh trong 1 giờ. Chạy bơm với tốc độ 5 mL/phút để nén gel, khi cột gel đã ổn định. Chạy tiếp qua đêm đểổn định cột với đệm phosphat pH 7.0.
+ Chạy sắc ký:
Dịch protein thô thu được sau khi phá vỡ tế bào được pha trong PBS (0,05M, pH 7,0). Thành phần protein của tế bào vi khuẩn được loại bỏ bằng
enzyme papain, protein G được kết tủa bằng ammonium sulfate 60 % bão hòa. Kết tủa được hòa tan trong PBS (0,05M, pH 7,0) và tiến hành tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sử dụng cột Sephadex G-50 (Amersham, Mỹ) thể tích 15 ml, tốc độ chảy 25ml/giờ, thu 20 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Đệm (pha
động) và mẫu đi qua cột. Các phân tử khuếch tán vào và ra khỏi các hạt của chất nền (cũng có thểđược mô tả như một sự phân tách giữa pha động và pha tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn sẽ đi sâu hơn vào trong chất nền và do đó được giữ lâu hơn trên cột.
Khi cho chất lỏng chảy liên tục qua cột, các phân tử có kích thước lớn hơn các lỗ sẽđược chảy trôi qua cột. Các phân tử nhỏ khuếch tán vào trong lỗ
và tồn tại lâu hơn trong cột.
Các phân tử lớn sẽ ra khỏi cột đầu tiên, sau đó dần dần tới các phân tử
nhỏ, tùy theo kích thước của chúng. Kết thúc quá trình chạy rửa hệ thống và cột và chạy cồn 20% để bảo quản cột. Các tiểu phần protein được thu trong mỗi phân đoạn được kiểm tra mức độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.