IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3. Phương pháp nghiên cứu
3.2. Phương pháp hóa sinh
3.2.1 Quy trình tách chiết, tinh sạch protein G từ vi khuẩn Streptococcus sp
Sơ đồ 2: Quy trình tách chiết và tinh sạch protein G từ vi khuẩn
Streptococcus sp
Dịch lên men 100ml
Ly tâm 9000 vòng/phút, thu tủa, bổ sung 10ml PBS 0,05M, pH=7
Phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sóng siêu âm
Bổ sung enzyme trypsin 50µg/ml ủ 1h, 37oC Dừng hoạt động enzyme bằng 0,5-1ml NaHCO3 7.5% Ly tâm 10 000 vòng/ phút (20 phút), thu dịch Kết tủa protein
Ly tâm, thu tủa, bổ sung đệm PBS
Chạy sắc ký lọc gel Sephadex G-50
3.2.2. Phương pháp thu nhận protein G thô từ Streptococus sp
• Kết tủa bằng muối ammonium sulfate (NH4)2SO4
Dịch protein sẽđược kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 bão hòa 60%, sau đó
được thẩm tích loại muối trong túi bán thấm.
• Kết tủa bằng dung môi hữu cơ aceton.
Dịch protein sẽđược kết tủa bằng aceton lạnh, với tỷ lệ Vdịch:Vaceton = 1:1. Quy trình kết tủa thực hiện theo các bước sau:
- Giữ aceton trong tủ lạnh sau -20oC.
- Bổ sung từ từ aceton vào mẫu với tỉ lệ 1:1
- Vontex, sau đó ủ 1 tiếng trong tủ -20oC.
- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút.
- Loại dịch, thu cặn.
- Để tủa khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong không khí.
- Sau đó bổ sung đêm hoặc nước cất 1ml, bảo quản -4oC [4]
3.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng theo phương pháp Bradforfd - Mục đích: Xác định nồng độ protein G thu được để chọn mẫu nghiên - Mục đích: Xác định nồng độ protein G thu được để chọn mẫu nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Tiến hành:
Hàm lượng protein-enzyme đã được xác định vào năm 1976 bằng phương pháp Bradford. Dựa vào sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm coomassie brilliant blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính axit, thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465nm, khi tạo phức với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Dựa vào độ hấp thụ quang của phức thuốc nhuộm-protein ở bước sóng 595nm tính được hàm lượng protein trong dung dịch. Để xác định được hàm lượng protein trong mẫu, đầu tiên cần phải xây dựng dường chuẩn với dụng dịch protein chuẩn đã biết nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là BSA
Đường chuẩn có dạng: y= ax+b, phương sai R2>= 0.95.
Từ đường chuẩn dựng được, tiến hành đo hàm lượng protein trong mẫu: cứ 100µl dung dịch protein pha loãng vào 900µl nước cất, bổ sung 2ml Brardford. Hỗn hợp phản ứng được giữu ở nhiệt độ phòng cứ 1 phút lắc 1 lần, trong vòng 5 phút, sau đó đo OD. Dựa vào đồ thị đường chuẩn tính hàm lượng protein tổng trong mẫu theo công thức:
X(mg/ml)= (∆Abs- b)/a x D x (1000/Vo) (1)
Trong đó: X : Hàm lượng protein có trong mẫu phản ứng
∆Abs : Giá trị hấp thụ quang phổ của mẫu ở 595nm D : Hệ số pha loãng của protein
V0 : Thể tích protein mẫu trong phản ứng với Bradford [4]
3.2.4. Phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-50
•Mục đích
Thu được các peptide với khối lượng phân tử mong muốn trong đó loại bỏđược tạp và peptide lớn.
•Tiến hành
+ Nhồi cột:
Gel G-50 được làm trương nở ở nhiệt độ phòng trong nước cất khoảng 3 giờ. Cột sắc ký được rửa sạch. Cho khoảng 2-3 mL nước cất vào trước. Tiếp theo cho gel vào theo dòng liên tục. Khi cho hết thể tích gel, đợi cột ổn định ở
áp suất tĩnh trong 1 giờ. Chạy bơm với tốc độ 5 mL/phút để nén gel, khi cột gel đã ổn định. Chạy tiếp qua đêm đểổn định cột với đệm phosphat pH 7.0.
+ Chạy sắc ký:
Dịch protein thô thu được sau khi phá vỡ tế bào được pha trong PBS (0,05M, pH 7,0). Thành phần protein của tế bào vi khuẩn được loại bỏ bằng
enzyme papain, protein G được kết tủa bằng ammonium sulfate 60 % bão hòa. Kết tủa được hòa tan trong PBS (0,05M, pH 7,0) và tiến hành tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sử dụng cột Sephadex G-50 (Amersham, Mỹ) thể tích 15 ml, tốc độ chảy 25ml/giờ, thu 20 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Đệm (pha
động) và mẫu đi qua cột. Các phân tử khuếch tán vào và ra khỏi các hạt của chất nền (cũng có thểđược mô tả như một sự phân tách giữa pha động và pha tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn sẽ đi sâu hơn vào trong chất nền và do đó được giữ lâu hơn trên cột.
Khi cho chất lỏng chảy liên tục qua cột, các phân tử có kích thước lớn hơn các lỗ sẽđược chảy trôi qua cột. Các phân tử nhỏ khuếch tán vào trong lỗ
và tồn tại lâu hơn trong cột.
Các phân tử lớn sẽ ra khỏi cột đầu tiên, sau đó dần dần tới các phân tử
nhỏ, tùy theo kích thước của chúng. Kết thúc quá trình chạy rửa hệ thống và cột và chạy cồn 20% để bảo quản cột. Các tiểu phần protein được thu trong mỗi phân đoạn được kiểm tra mức độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.
3.2.5. Phương pháp SDS-PAGE
- Mục đích: Xác định trọng lượng phân tử của protein thu nhận được và kiểm tra độ tinh sạch của mẫu protein G sau tinh chế.
- Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch chạy điện di
+ Đệm mẫu gồm: Nước, 0.5M tris pH 6.8, glycerol, 20% SDS,
Bromophenol blue, β-mercaptoethanol.
• Separating gel Hóa chất Thể tích bản gel 30% Acrylamide/bis – acrylamide 1.5M tris – HCl (pH 8.8) SDS 10% Nước cất
Amonium persulfate 10% (AP)
N.N.N’.N’ – tetrsmethylene diamin (TEMED)
4ml 2.5ml 100µl 3.4ml 50µl 10µl • Stacking gel Hóa chất Thể tích bản gel
30% Acrylamide/0.8% bis – acrylamide 0.5M tris – HCl (pH 6.8)
SDS 10% Nước cất
Amonium persulfate 10% (AP)
N.N.N’.N’ – tetrsmethylene diamin (TEMED)
1.3ml 2.5ml 100µl 6.1ml 50µl 10µl
+ Dung dịch nhuộm và tẩy màu gel:
Dung dịch nhuộm gel gồm: Coomasive brilliant blue G250, methanol, acetic acid.
Dung dịch tẩy màu gel: Methanol, acetic acid, nước. + Tiến hành điện di:
Nạp 20 µL mẫu/giếng gel, với protein chuẩn 5 µL/ giếng, chạy ở điện áp 70V, cường độ 30 mA. Sau khi lượng mẫu đã chạy xuống mép dưới của tấm kính thì tiến hành nhuộm màu với dung dịch nhuộm. Nhuộm qua đêm, sau đó
tẩy màu gel nhuộm đến khi nền bản gel sáng lên, làm khô bản gel để chụp ảnh và lưu giữ mẫu.
+ Đọc kết quả
Việc đọc kết quả sẽ căn cứ vào band protein chuẩn đã biết trước trọng lượng phân tử.
3.2.6.Phương pháp Western blot
Là kỹ thuật lai giữa protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng thể), protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.
Quy trình:
- Điện di biến tính protein trên gel SDS - PAGE.
- Chuẩn bị màng lai: Hoạt hóa màng PVDF trong metanol khoảng 15 giây rồi rửa lại bằng nước cất 3 lần. Chuyển sang dung dịch đệm chuyển màng.
- Ngâm giấy thấm dùng cho điện chuyển trong dung dịch đệm chuyển màng.
- Chuyển màng: Xếp màng PVDF và gel trong hệ thống chuyển màng theo thứ tự giấy thấm – màng PVDF – gel – giấy thấm.
- Lắp hệ thống chuyển màng, chuyển màng ở 100mA trong 1 giờ 30 phút.
- Sau khi chuyển, màng được rửa trong PBS-T trong 5 phút, lắc nhẹ. - Blocking màng bằng blocking buffer trong 1 giờ, lắc.
- Phủ kháng thể 1(kháng protein G): Ủ màng trong 5ml dung dịch chứa kháng thể 1 với độ pha loãng thích hợp, lắc ở 20°C qua đêm.
- Phủ kháng thể 2 (kháng thể kháng kháng thể 1 có cộng hợp perosidase):
Ủ màng trong 5ml dung dịch chứa kháng thể 2 với độ pha loãng thích hợp, lắc 1 giờở nhiệt độ phòng.
- Rửa màng 3 lần bằng PBS-T, mỗi làn 5 phút, lắc nhẹ.
- Hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất TMB cho đến khi hiện băng. Xem kết quả dưới ánh sáng thường.
3.3. Phương pháp Elisa gián tiếp kiểm tra khả năng gắn kết kháng thể động vật của Protein G động vật của Protein G
- Mục đích: Kiểm tra khả năng gắn gắn kết kháng thểđộng vật của Protein G - Tiến hành:
Trình tự phản ứng:
Bước 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ
5µg/giếng được gắn trực tiếp vào đĩa ELISA. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở
nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 3. Gắn kháng thể: 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ 1/400 bằng dung dịch PBS – sữa tách bơ 5%. Kháng thểủ trong đĩa ở nhiệt độ 37oC, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài: 100µl goat anti-rabbit IgG HRPO (Sigma) pha loãng 1/10.000 nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ
dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 5 lần, và làm khô.
Bước 4. Cơ chất tạo màu: 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ
phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2¬SO4 1M, lúc này phản ứng có màu vàng. Bước 5. Đọc kết quả trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.
PHẦN II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1. Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus sp 1.1. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn có hình cầu, gram dương 1.1. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn có hình cầu, gram dương
Mẫu sử dụng trong nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Streptococcus sp là các mẫu nội tạng lợn, gà, vịt. Dựa trên mô tả lần đầu tiên của Billroth, vi khuẩn Streptococcus sp là vi khuẩn có hình cầu, bắt màu gram dương.
Theo các bước phân lập đã trình bày ở sơ đồ 1, chúng tôi đã phân lập và sàng lọc được 24 chủng có hình thái vi khuẩn là hình cầu và bắt màu Gram dương
được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.1: Kết quả phân lập 24 chủng vi khuẩn hình cầu, Gram dương
ST T Ký hiệu chủng Màu sắc khuẩn lạc
Hình thái khuẩn lạc Gram Hình thái vi khuẩn 1 S3.2.2 Trắng sữa Tròn, to, bóng, viền nhám + Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ 2 S2.1 Vàng đục Tròn, to, bóng, tâm hơi lồi + Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ 3 S3.6.1 Trắng trong Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Liên cầu khuẩn 4 S Vàng đục Tròn, to, bóng, nhẵn + Liên cầu
khuẩn 5 S4.2.1 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Liên cầu khuẩn 6 S4.5.2 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng, tâm lồi thấp + Liên cầu khuẩn 7 S5.5.2 Trắng sữa Tròn, to, viền nhăn + Liên cầu khuẩn
8 S5.2.3 Trắng đục To, trơn, bóng, lồi cao + Liên cầu
khuẩn 9 S5.4.2 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng, tâm lồi + Liên cầu 10 S5.6.1 Trắng đục Tròn, to, bóng, nhẵn + Liên cầu khuẩn 11 S5.6.3 Trắng sữa Tròn, bóng, tâm hơi lồi + Liên cầu khuẩn 12 S5.7.1 Trắng trong Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Liên cầu khuẩn 13 S5.8.3 Trắng trong Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Liên cầu khuẩn 14 S6.3.3 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Liên cầu khuẩn 15 S6.4.3 Trắng Trong Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Cầu khuẩn 16 S6.5.1 Trắng đục Tròn, to, bóng, nhẵn + Cầu khuẩn 17 S6.7.4 Trắng Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Cầu khuẩn
Trong 18 S7.1.1 Vàng đục Tròn, to, bóng + Liên cầu khuẩn 19 S7.3.1 Vàng đục Tròn, to, bóng, nhẵn + Liên cầu khuẩn 20 S8.1.1 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng + Liên cầu khuẩn 21 S8.2.2 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Cầu khuẩn 22 S8.2.3 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng, nhẵn + Cầu khuẩn
23 S8.4.1 Trắng đục Không tròn, to, bóng + Cầu khuẩn
24 S8.5.2 Trắng sữa Tròn, nhỏ, bóng, tâm
lồi thấp
+ Liên cầu
khuẩn Từ kết quả phân lập và sàng lọc được 24 chủng vi khuẩn trên, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các phản ứng sinh hóa để tuyển chọn vi khuẩn
Streptococcus sp
1.2. Đặc điểm hình thái tế bào và đặc tính sinh lí, sinh hoá của các chủng vi khuẩn Streptococcus sp phân lập được vi khuẩn Streptococcus sp phân lập được
Theo Dương Văn Hợp và Nguyễn Lân Dũng (2007), phương pháp phân loại truyền thống vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào, khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành [17][18]… Từ đó, chúng tôi đã tập trung nghiên cứu các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho vi khuẩn Streptococcus sp và đã thực hiện các thử nghiệm như khả năng lên men đường glucose, lactose, sinh gas, sinh H2S, sinh Indol, sinh enzyme catalase và khả năng dung huyết. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lí, sinh hoá chung của vi khuẩn Streptococcus sp như sau:
• Đặc điểm hình thái: là liên cầu khuẩn, bắt màu gram dương, không có tiên mao, đôi khi có hình trứng
• Đặc điểm sinh hóa: vi khuẩn Streptococcus sp có khả năng lên men
đường glucose, không lên men lactose, không có khả năng sinh hơi, không sinh H2S, không sinh indol và không sinh enzyme catalase. Vi khuẩn có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu 5%
Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, 48h trên môi trường BHIA, kết quả cho thấy xuất hiện 7 chủng vi khuẩn có hình thái như sau: kích thước nhỏ, màu trắng sữa, tròn đều, bóng, tâm lồi thấp. Hình thái tế bào dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần cho thấy các chủng vi khuẩn đều bắt màu gram dương, tế bào vi khuẩn dạng hình cầu, đôi lúc hình trứng, xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ. Như vậy, trong số 24 chủng vi khuẩn phân lập được thì chúng tôi đã sàng lọc ra được 7/24 chủng vi khuẩn là các chủng S3.6.1 , S4.5.2, S5.4.2, S7.3.1, S8.1.1, S8.2.3, S8.5.2 có đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào phù hợp với các chỉ tiêu và tài liệu nghiên cứu vềStreptococcus sp.
Các chủng vi khuẩn phân lập có đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào đặc trưng tiếp tục được khảo sát đặc tính sinh lí sinh hoá. Khi nuôi cấy trong môi trường Kligler Iron Agar (KIA), sau 24h các chủng gây hiện tượng đổi màu ở phần thạch đứngvì vậy được đánh giá là có khả năng lên men đường glucose, không đổi màu phần thạch nghiêng, không lên men
đường lactose. Cũng trên môi trường KIA, 7 chủng vi khuẩn phân lập không tạo kết tủa màu đen FeS vì vậy không sinh H2S.
Phản ứng sinh indol được đánh giá bằng thuốc thử Kovac′s. Canh khuẩn của các chủng nghiên cứu cho kết quả không có hiện tượng tạo vòng phản ứng màu đỏ với thuốc thử Kovac’s, do đó nó không khả năng sinh indol. Khi thử nghiệm khả năng sinh enzyme catalase với thuốc thử H2O2 30%, các chủng cũng cho kết quả âm tính. Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc vi
khuẩn có màu trắng, vòng phân giải hồng cầu có màu trắng sáng. Đây là đặc trưng của kiểu dung huyết β. Kết quảđược trình bày tại bảng 2.2 và hình 2.1.
Bảng 2.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên 24 chủng vi khuẩn đã sàng lọc
STT Ký hiệu chủng
Đặc điểm sinh hóa
Glucose Lactose Gas H2S Indol Catalase huyết Dung
1 S3.2.2 - - - + Β 2 S2.1 + - - - - + Β 3 S3.6.1 + - - - Β 4 S3.6.2 + - - - - + Β 5 S4.2.1 - - - + Β 6 S4.5.2 + - - - Β 7 S5.5.2 + - - - - + Γ 8 S5.2.3 - - - + Γ 9 S5.4.2 + - - - Β 10 S5.6.1 + + - - - - Γ 11 S5.6.3 + + - - - - Γ 12 S5.7.1 + + - - - + Γ 13 S5.8.3 + + - - - - Β 14 S6.3.3 - - - + Γ 15 S6.4.3 + + - - + - Β 16 S6.5.1 + - - - + + Β 17 S6.7.4 - - - + Γ 18 S7.1.1 + - - - - + Β