Nồng độ cơ chất trong môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm hình thành. Nồng độ cơ chất quá cao sẽ gây áp lực thẩm thấu lên thành tế bào vi khuẩn,
ức chế khả năng hấp thụ các thành phần dinh dưỡng khác. Kết quả khảo sát ngưỡng ức chế glucose đối với chủng được thể hiện qua đồ thị trong hình 3.5.
Hình 3.5 Khả năng hình thành sinh khối, L-lysine và lượng đường sót khi nuôi cấy chủng ở các nồng độ glucose khác nhau
Đồ thị cho thấy, các nồng độ đường khảo sát cho lượng sinh khối tương đương nhau và tương đương với mẫu đối chứng, chứng tỏ các nồng độ này chưa phải là nồng độ ức chế đối với sự hình thành sinh khối của chủng nghiên cứu.
Tuy nhiên, sự khác biệt về nồng độ đường ban đầu gây ảnh hưởng rõ rệt đến lượng L-lysine. Đồ thị cho thấy, ở nồng độ glucose 10g/L, lượng L-lysine thu được là thấp nhất (21,5g/L). Lượng L-lysine đạt cao nhất ở mẫu đối chứng, xấp xỉ 32g/L. Nồng độ glucose cao hơn (75g/L, 100g/L) không làm tăng lượng L-lysine mà thậm chí còn làm giảm, chứng tỏ khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng đã bị ức chế. Nồng độ đường cao gây áp lực thẩm thấu lên màng tế bào, ảnh hưởng đến sự vận chuyển các chất qua màng [2], dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, từ đó ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine. Tuy nhiên, nồng độ đường thấp sẽ không đáp ứng
21,57 31,83 30,65 25,52 0,09 16,78 19,7 24,69 9,11 9,13 9,11 9,12 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 0 5 10 15 20 25 30 35 10 50 75 100 Mật độ tế bào Log CFU/mL g/L Các nồng độ đường khảo sát (g/L) Lysine Đường sót Sinh khối (log CFU/mL)
được nhu cầu về dinh dưỡng của chủng, làm giảm khả năng hình thành sản phẩm. Có thể thấy, nồng độ đường 10g/L đã được chủng đã sử dụng triệt để cho giai đoạn hình thành sinh khối và một phần cho sản sinh L-lysine. Bước vào pha cân bằng, đây là giai đoạn sinh tổng hợp L-lysine, lúc này nguồn cơ chất đã cạn kiệt, không đủ để chủng tiếp tục hình thành L-lysine, dẫn đến lượng L-lysine sinh ra ít hơn. Do đó, việc khảo sát nồng độ đường tối ưu cho quá trình lên men là cần thiết. Với mục đích thu nhận L- lysine, nồng độ glucose trong canh trường cần duy trì trong giới hạn cho phép trên 10g/L và dưới 100g/L, tốt hơn là dao động xung quanh mức 50g/L. Việc tăng hay giảm lượng đường ban đầu đều làm giảm lượng L-lysine.
Nghiên cứu của tác giả Hadj Sassi (1988) về sản xuất L-lysine ở chủng
Corynebacterium glutamicum sp. cho thấy, nồng độ glucose trong khoảng 60-233g/L gây ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành L-lysine của chủng, nhưng nồng độ 65g/L của glucose cho sản lượng L-lysine cao nhất [15].
Các tác giả Jong W. Oh, Seoung J.Kim, Young J. Cho, Nai H. Park, Jae H. Lee (1993) đã so sánh khả năng tổng hợp L-lysine của hai chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum YJ 150 và Corynebacterium glutamicum CS 755. Trong đó, YJ 150 là chủng ban đầu, sau khi gây đột biến tạo ra chủng CS 755 mang gen kháng S-(β- aminoethyl)-L-cystein (AEC), arginine, methyl lysine, α-amino-β-hydroxyvaleric acid. Để chứng minh vai trò của các đột biến đối với sản lượng L-lysine, các tác giả đã nuôi cấy hai chủng này trên môi trường có hàm lượng glucose 75g/L, kết quả L-lysine thu được: 30 g/L (chủng YJ 150) và 34 g/L (chủng CS 755) [11].
Tác giả Nguyễn Thùy Châu (2006) nghiên cứu khả năng sản xuất L-lysine của chủng Corynebacterium glutamicum CM24, đây là chủng đột biến dị dưỡng homoserine. Lên men trên môi trường có hàm lượng glucose 100g/L, hình thức lên men chìm có sục khí đã thu được sản lượng L-lysine 22-25g/L. Lên men trên môi trường rỉ đường, tác giả thu được sản lượng cao hơn (30g/L) [1].
Từ những nghiên cứu trên cho thấy, nguồn đường và nồng độ đường trong môi trường có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình lên men. Tuy nhiên, chủng giống khác nhau có yêu cầu về hàm lượng đường trong môi trường khác nhau. Ngoài ra còn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
Như vậy, trong môi trường lên men chủng Corynebacterium glutamicum-B-0632 thu nhận L-lysine, nồng độ glucose cần duy trì trong giới hạn: trên 10g/L và dưới 100g/L, mẫu đối chứng với nồng độ glucose 50g/L cho lượng L-lysine cao nhất, đạt xấp xỉ 32g/L ở thời điểm 32 giờ.
Tóm lại, sau khi tiến hành một số thí nghiệm khảo sát, chúng tôi đưa ra được chế độ fed-batch như sau:
- Nguồn cơ chất bổ sung: glucose
- Thời điểm bổ sung cơ chất: 20 giờ
- Chu kỳ bổ sung cơ chất: 2 giờ
- Nồng độ cơ chất bổ sung: 25%
Trên cơ sở này, tiến hành thử nghiệm lên men fed-batch thu nhận L-lysine.
3.3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận
L-lysine
Công nghệ lên men amino acid thường đòi hỏi nồng độ đường cao để thu được nhiều sản phẩm. Tuy nhiên, lượng đường ban đầu cao trong môi trường nuôi cấy sẽ ức chế khả năng sinh trưởng của tế bào, giảm khả năng trao đổi chất, từ đó làm giảm sản lượng. Vì vậy, bắt đầu nuôi cấy với hàm lượng đường vừa đủ và bổ sung theo từng giai đoạn sẽ cải thiện đáng kể sản lượng amino acid.
Giai đoạn đầu, lên men fed-batch được bố trí giống lên men batch. Tỷ lệ giống bổ sung 7%, điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng, pH môi trường lên men 7-7,2, chế độ lắc vòng 150 vòng/phút.
Thời điểm 20 giờ bắt đầu bổ sung glucose, chu kỳ bổ sung là 2 giờ giúp ổn định lượng đường trong môi trường để chủng hoạt động tốt. Lên men trong 48 giờ, bổ sung glucose 14 lần. Thể tích môi trường ban đầu là 250mL. Cuối mỗi thời điểm, lấy 5mL mẫu để phân tích các chỉ tiêu: mật độ tế bào/mL, lượng L-lysine và đường sót, đồng thời bổ sung 5mL dung dịch đường glucose 25%.
Kết quả lên men fed-batch được thể hiện qua đồ thị hình 3.6.
Hình 3.6 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong quá trình lên men fed-batch chủng Corynebacterium glutamicum-B-0632
Việc bổ sung glucose trong suốt thời gian lên men đã làm tăng đáng kể lượng L- lysine. Thời điểm 48 giờ, L-lysine đạt 43g/L, tăng đáng kể so với lên men batch ở thời điểm 48 giờ với 34g/L. Khả năng sinh trưởng của chủng cũng mạnh hơn so với lên men batch. Với hình thức lên men batch, qua 20 giờ nuôi cấy, sinh khối không tăng, sau đó có xu hướng giảm. Đối với fed-batch, sinh khối vẫn tiếp tục tăng đến 48 giờ, đồ thị không có biểu hiện đi xuống. Lượng đường sót trong canh trường có sự tăng giảm do glucose được bổ sung thêm trong suốt quá trình lên men.
Các đồ thị 3.7, 3.8 và 3.9 thể hiện rõ hơn sự khác nhau giữa lên men batch và fed- batch. 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 Mật độ tế bào Log CFU/mL
Thời gian (giờ)
g/L
Đường sót (g/L) Lysine (g/L) Mật độ TB (log CFU/mL)
Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine trong lên men batch và fed-batch
Trong 20 giờ đầu, lượng L-lysine là tương đương ở hai hình thức lên men. Đối với fed-batch, sau 20 giờ, glucose bắt đầu được bổ sung vào môi trường lên men làm lượng L-lysine ở những thời điểm sau cao hơn so với L-lysine cùng thời điểm thu được bằng lên men batch. Nguyên nhân do nồng độ đường luôn được giữ ở mức phù hợp, hoạt động trao đổi chất của chủng nghiên cứu luôn ở mức cao nên sinh ra nhiều sản phẩm. Kết thúc quá trình, tại thời điểm 48 giờ, L-lysine đạt được ở lên men batch là 34g/L và lên men fed-batch là 43g/L, tăng 21% so với dạng batch.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 10 20 30 40 50 60 L-lysine g/L
Thời gian (giờ)
fed-batch batch
Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả năng sinh trưởng của chủngtrong lên men batch và fed-batch
Mật độ tế bào ở 20 giờ đầu lên men ở mức tương đương giữa hai hình thức lên men. Sau khi được bổ sung thêm glucose từ giai đoạn 20 giờ trở đi, mật độ tế bào trong lên men fed-batch cao hơn, chứng tỏ chủng tăng sinh mạnh hơn, lượng cơ chất bổ sung đã được sử dụng. Cuối quá trình lên men, mật độ tế bào ở hình thức lên men batch bắt đầu giảm (thời điểm 40 giờ), trong khi đó, ở hình thức fed-batch, mật độ tế bào vẫn tăng, đồ thị biểu diễn không có xu hướng đi xuống.
5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 0 10 20 30 40 50 60 Mật độ tế bào Log CFU/mL
Thời gian (giờ)
Fed-batch Batch
Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót trong lên men batch và fed-batch
Lượng đường sót trong canh trường có sự khác biệt rõ ở hai hình thức lên men. Đối với batch, lượng đường sót giảm tuyến tính theo thời gian. Đối với fed-batch, lượng đường sót có sự tăng giảm không đi theo đường tuyến tính do glucose được bổ sung trong quá trình lên men. Tuy nhiên, lượng đường trong canh trường từ thời điểm 20 giờ trở đi luôn được duy trì ở nồng độ thích hợp nên quá trình trao đổi chất của chủng diễn ra mạnh, làm tăng khả năng sinh tổng hợp L-lysine.
Các công trình nghiên cứu của các tác giả nước ngoài về lên men fed-batch
Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine hầu hết đều thực hiện theo hình thức fed-batch liên tục trên hệ thống tự động. Việc kiểm soát nồng độ oxy hoàn tan và pH trong suốt quá trình lên men đều được tự động hóa. Lượng L-lysine thu được của những nghiên cứu này rất cao, gấp đôi thậm chí gấp 3 lần so với lên men batch.
Tác giả J. Xu và M. Han (2013) lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum
trong fermentor 7L. Dung dịch bổ sung gồm glucose 800g/L và (NH4)2SO4 400g/L. Lượng L-lysine thu được 96,8g/L chỉ sau 36 giờ lên men [33].
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 0 10 20 30 40 50 60 Đường sót g/L
Thời gian (giờ)
Fed-batch Batch
Tác giả Judith Becker (2011) lên men Corynebacterium glutamicum trên hệ thống Biostat với bình lên men 5L. Dịch fed-batch bao gồm: 200g rỉ đường và 800g glucose được hòa tan trong 1,8L nước, hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. 200mL (NH4)2SO4 (40%) được hấp riêng. 0,8 mL dịch vitamine và 2mL antifoam được bổ sung sau. Lượng L-lysine thu được là 120g/L sau 30 giờ nuôi cấy [8].
Tác giả Zhen Chen (2011) tiến hành lên men Corynebacterium glutamicum trên fermentor 2L. Dịch bổ sung bao gồm glucose 50%, NH4Cl 4,5% và biotine 0,5mg/L. Lên men trong 30 giờ thu được lượng L-lysine 58g/L [10].
Tác giả Mikiro Hayashi (2006) lên men fed-batch hai chủng Corynebacterium glutamicum ADL-3 và AHD-2 trong fermentor 5L. Sau 30 giờ, lượng L-lysine thu được lần lượt là 83g/L và 73g/L. Nguồn cơ chất được chọn để bổ sung trong suốt quá trình lên men là glucose [17].
Từ những nghiên cứu trên cho thấy, lượng L-lysine thu nhận được khác nhau tùy chủng giống, tùy môi trường lên men, thành phần cũng như nồng độ những chất bổ sung. Nhưng có một điều không thể phủ nhận đó là, hình thức lên men fed-batch luôn thu được lượng L-lysine cao hơn nhiều so với lên men batch.
Bảng 3.8 So sánh lên men batch và fed-batch Hình thức lên
men
Tổng thời gian lên men (giờ)
L-lysine (g/L) Năng suất (g/L/giờ) Fed-batch 48 43 0,9 Batch 48 34 0,7
Từ những số liệu trên cho thấy, lên men fed-batch cho sản lượng cao hơn hẳn lên men batch trong cùng thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, lên men fed-batch dạng liên tục cần có hệ thống lên men cùng các thiết bị hỗ trợ kiểm soát môi trường trong suốt quá trình vận hành. Đây là những thiết bị đắt tiền, người vận hành cần có những kiến thức nhất định để điều khiển hệ thống. Đây là nguyên nhân khiến hình thức lên men batch hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi hơn trong công nghiệp lên men sản xuất amino acid.
Tóm lại, sau khi lên men fed-batch chủng Corynebacterium glutamicum-B-0632, bắt đầu bổ sung glucose tại thời điểm 20 giờ, nồng độ glucose bổ sung 25%, chúng tôi thu được lượng L-lysine cao hơn 21% so với dạng batch sau 48 giờ. Kết quả khả quan này cho phép làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo với quy mô lớn hơn trên nguồn cơ chất ít tốn kém hơn để tiết kiệm chi phí và nâng cao năng suất.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
A. Kết luận
Qua những thí nghiệm khảo sát, đề tài có những kết luận sau:
- Chủng nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (+), có khả năng đồng hóa nhiều nguồn carbon và nitơ khác nhau.
- Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được môi trường tối ưu lên men theo mẻ (batch) chủng Corynebacterium glutamicum -B-0632 thu nhận L-lysine: (NH4)2SO4 15,8579g/L, dịch bắp 29,2893mL/L, glucose 50g/L, KH2PO4 1g/L, hỗn hợp muối khoáng 5mL/L, biotine 20µg/L, thiamine 150µg/L, tween 20 5mL/L. Lượng giống bổ sung 7%, điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH 7-7,2, chế độ lắc vòng 150 vòng/phút. Kết quả, sau 48 giờ lên men, sản lượng L-lysine thu được trên môi trường này đạt 34g/L. Tuy nhiên, nên thu nhận L-lysine ở thời điểm 32 giờ (32g/L) để tiết kiệm chi phí kéo dài thời gian lên men.
- Chế độ fed-batch:
Nguồn cơ chất bổ sung: glucose Thời điểm bổ sung cơ chất: 20 giờ Chu kỳ bổ sung cơ chất: 2 giờ Nồng độ cơ chất bổ sung: 25%
- Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) chủng Corynebacterium glutamicum -B-0632 trên môi trường tối ưu, sau 48 giờ, lượng L-lysine đạt 43g/L, tăng 21% so với lên men theo mẻ (batch).
B. Kiến nghị
Với những kết quả đề tài đã đạt được, chúng tôi kiến nghị một số hướng như sau để góp phần hoàn thiện đề tài:
• Bố trí thí nghiệm khảo sát ngưỡng ức chế sâu hơn.
• Tối ưu điều kiện lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine.
• Tối ưu quá trình lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum.
• Định lượng amino acid L-lysine bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ở thí nghiệm tối ưu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Nguyễn Thùy Châu (2006), Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm axit amin và enzim từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải sản ở quy mô bán công nghiệp, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp nhà nước.
2. Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục, Việt Nam.
3. Nguyễn Văn Dự; Nguyễn Đăng Bình (2011), Quy hoạch thực nghiệm trong kỹ thuật, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
4. Nguyễn Đức Lượng (2010), Vi sinh vật học công nghiệp, Nxb Đại học Quốc gia, TP. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Thị Hoa Lý; Lê Đức Ngoan; Lê Khắc Huy (1996), Hiệu quả bổ sung chế phẩm L.lysine trong khẩu phần gà đẻ giống Brown Nick, Tạp chí NN& CNTP, 11, p. 742-744.
6. Nguyễn Thị Hoa Lý; Lê Đức Ngoan; Lê Khắc Huy (1996), Hiệu quả bổ sung chế phẩm L-lysine và DL-methionine trong khẩu phần gà thịt AE ở Quảng Nam-Đà Nẵng, Tạp chí NN& CNTP, 4, p. 172-174.
7. Trần Thị Minh Tâm; Nguyễn Thúy Hương (2009), Tối ưu quá trình lên men thu nhận amino acid L-lysine từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-656,
Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 25, p. 172-178.
Tài liệu tham khảo tiếng Anh