lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 3.2.1. Thí nghiệm sàng lọc
Trong quá trình lên men thu nhận L-lysine, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine của chủng. Trong đó, môi trường lên men có ảnh hưởng trực tiếp. Tuy nhiên, không phải tất cả các thành phần trong môi trường lên men đều có ảnh hưởng như nhau đến lượng L-lysine. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sàng lọc để tìm ra những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu là lượng L-lysine. Kết quả thí nghiệm sàng lọc thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc TN X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Y (L-lysine ) 1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 34,296 2 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 24,508 3 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 35,284 4 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 34,316 5 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 26,836 6 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 32,25 7 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 24,79 8 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 27,41 9 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 24,34 10 1 -1 -1 1 1 1 1 -1 25,16 11 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 33,89 12 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 26,37
Từ bảng kết quả cho thấy, ở thí nghiệm thứ 3, glucose (-), biotine (-), dịch bắp (+), cho lượng L-lysine cao nhất, đạt 35,284g/L. Thí nghiệm thứ 9, muối khoáng (+), các yếu tố còn lại ở mức (-) cho lượng L-lysine thấp nhất, đạt 24,34g/L trong cùng điều kiện và thời gian lên men (48 giờ). Để đánh giá chính xác ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm mục tiêu, tiến hành phân tích hồi quy-phương sai.
Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát
Các yếu tố khảo sát Ký hiệu Mức ảnh hưởng Giá trị P
Glucose X1 3,3257 0,066 (NH4)2SO4 X2 5,2223 0,021 KH2PO4 X3 -0,9983 0,458 Hỗn hợp muối khoáng X4 -1,6937 0,245 Biotin X5 -1,7683 0,229 Thiamin X6 -0,4717 0,715 Tween 20 X7 1,2590 0,362 Dịch bắp X8 4,6463 0,029
Giá trị P là giá trị xác suất thống kê về mức độ quan trọng của từng yếu tố thí nghiệm đối với hàm mục tiêu. Những yếu tố có giá trị P tương ứng nhỏ hơn mức ý nghĩa α (α = 0,05) là những yếu tố có ý nghĩa thống kê về mức độ ảnh hưởng. Nói cách khác, yếu tố có giá trị P <α thì ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu, và ngược lại.
Quan sát cột giá trị P trong bảng 3.3 cho thấy, yếu tố X2 và X8 là hai yếu tố có giá trị P tương ứng nhỏ hơn 0,05, chứng tỏ đây là hai yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu. Các yếu tố còn lại có giá trị P lớn hơn nhiều so với mức ý nghĩa α, cho thấy các yếu tố này không gây ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu.
Độ lớn của các hệ số ảnh hưởng (hay giá trị tuyệt đối của các hệ số) cho biết mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đối với hàm mục tiêu. Dấu (+) hay (-) của hệ số cho biết tác động của yếu tố đối với hàm mục tiêu là dương hay âm. Dấu (+) biểu thị sự tác động dương, dấu (-) biểu thị sự tác động âm. Nghĩa là, những yếu tố có hệ số ảnh hưởng (+) nếu được nhận giá trị cao hơn mức trung tâm sẽ làm tăng giá trị hàm mục tiêu. Tương tự, những yếu tố có hệ số ảnh hưởng (-) nếu được nhận giá trị cao hơn mức trung tâm sẽ làm giảm giá trị hàm mục tiêu.
Hệ số ảnh hưởng của yếu tố X2 và X8 có giá trị lớn nhất trong 8 yếu tố khảo sát và đều mang giá trị (+) cho thấy, nếu hai yếu tố này nhận được giá trị cao hơn mức trung tâm thì sẽ làm tăng giá trị hàm mục tiêu. Chứng tỏ, lượng L-lysine phụ thuộc lớn vào
hai yếu tố này. Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2 (R-Sq) = 94,32% chứng tỏ mô hình tìm được khá phù hợp với dữ liệu.
Như vậy, qua sàng lọc, chúng tôi xác định được hai yếu tố có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng giống, đó là (NH4)2SO4 và dịch bắp. Trên cơ sở này, tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình và các thông số thí nghiệm.
3.2.2. Thí nghiệm khởi đầu
Sau khi sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu, tiếp tục tiến hành một số thí nghiệm với các yếu tố này, có bổ sung 5 thí nghiệm ở mức trung tâm. Giá trị trung tâm cho phép đánh giá mức độ phù hợp (Lack of fit) của mô hình hồi quy bậc nhất đã xây dựng. Đây là thông tin quan trọng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả thí nghiệm khởi đầu được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khởi đầu
TN (NH4)2SO4 Dịch bắp Y (L-lysine g/L) 1 -1 -1 37,69 2 0 0 33,20 3 0 0 33 4 -1 1 32 5 0 0 33,80 6 1 1 32,59 7 1 -1 36,80 8 0 0 33,70 9 0 0 33,50
Kết quả thí nghiệm cho thấy, lượng L-lysine đạt cao nhất 37,69g/L khi hai yếu tố ảnh hưởng được bố trí ở dưới mức trung tâm (thí nghiệm 1). Tuy nhiên, lượng L-lysine sẽ giảm còn 32g/L nếu tăng lượng dịch bắp lên trên mức trung tâm (thí nghiệm 4).
Thông số quan trọng để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình hồi quy là giá trị P của “Lack of fit”. Nếu giá trị P của “Lack of fit” lớn hơn mức ý nghĩa α thì chấp nhận
mô hình hồi quy bậc nhất, nghĩa là hàm mục tiêu còn xa vùng cực trị. Ngược lại, nếu giá trị P nhỏ hơn α thì mô hình hồi quy bậc nhất không được chấp nhận, nghĩa là hàm mục tiêu được mô tả bằng mô hình hồi quy bậc cao hơn.
Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu
Chỉ tiêu Giá trị P Lack of fit Main Effects Ct Pt Curvature 0,003 0 0,007 0,007 r2 (R-Sq) = 96,61%
Phân tích hồi quy-phương sai thu được giá trị P của “Lack of fit” là 0,003, nhỏ hơn nhiều so với mức ý nghĩa α, điều này nghĩa là mô hình hồi quy bậc nhất không phù hợp. Các ảnh hưởng chính (Main Effects) có giá trị P bằng 0 chứng tỏ các yếu tố ảnh hưởng chính có ý nghĩa về mặt thống kê. Giá trị P của các điểm trung tâm (Ct Pt) là 0,007; nhỏ hơn α chứng tỏ các điểm trung tâm có ảnh hưởng đáng kể đến mô hình hồi quy. Giá trị P của “Curvature” (đường cong) bằng 0,007, nhỏ hơn nhiều so với α cho thấy khả năng xuất hiện dạng cong của bề mặt chỉ tiêu là rất lớn. Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2
(R-Sq) = 96,61% cho thấy mô hình tìm được khớp với số liệu thực nghiệm.
Để tìm chính xác điểm cực trị của hàm mục tiêu, cần tiến hành thêm các thí nghiệm mà ở đó, mỗi yếu tố phải được bố trí nhiều hơn 3 mức giá trị. Đây là cơ sở để tiến hành thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay (RSM-CCD).
3.2.3. Thí nghiệm bề mặt đáp ứng RSM-CCD
Thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay sẽ bổ sung thêm các điểm thí nghiệm nhằm xây dựng mô hình hồi quy bậc 2 mô tả hàm mục tiêu.
Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.5.
Từ bảng kết quả cho thấy, lượng L-lysine đạt cao nhất 38g/L (thí nghiệm 11) khi (NH4)2SO4 ở mức trung tâm và dịch bắp ở mức giá trị biên –α. Thí nghiệm 4, lượng L- lysine thu được thấp nhất (31g/L) khi (NH4)2SO4 ở mức trung tâm và dịch bắp ở mức giá trị biên +α.
Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD TN (NH4)2SO4 Dịch bắp Y (L-lysine g/L) 1 0 0 33,20 2 0 0 33 3 0 0 33,80 4 0 +1,41 31,31 5 -1 1 32,37 6 0 0 33,70 7 0 0 33,50 8 -1,41 0 34,88 9 -1 -1 37,32 10 1 -1 37,17 11 0 -1,41 38,24 12 +1,41 0 34,67 13 1 1 32,22 1,41: mức giá trị biên (α)
Phân tích hồi quy-phương sai cho thấy, phương trình hồi quy có dạng: Y (L-lysine) = 47,234 – 0,4065X2 – 0,1025X8 +0,0067X22 + 0,0003X82 Trong đó, X2 là (NH4)2SO4, X8 là dịch bắp.
Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2
(R-Sq) đạt 99,17%, giá trị P của “Lack of fit” bằng 1,0 chứng tỏ mô hình tìm được khớp với dữ liệu.
Dấu (+) của hệ số trong phương trình thể hiện ảnh hưởng dương của yếu tố đối với hàm mục tiêu, dấu (-) thể hiện ảnh hưởng âm đối với hàm mục tiêu.
Qua phương trình hồi quy ta thấy, ở dạng hàm bậc nhất, X2 mang hệ số(-0,4065), ảnh hưởng âm đến hàm mục tiêu. Còn ở dạng hàm bậc hai (X22) mang hệ số (+0,0067), ảnh hưởng dương đến giá trị hàm mục tiêu, tuy nhiên, hệ số này rất nhỏ nên ảnh hưởng
là không đáng kể. Như vậy, nếu tăng lượng (NH4)2SO4 lên trên mức trung tâm sẽ làm giảm giá trị hàm mục tiêu. Kết quả thí nghiệm trong bảng 3.5 cho thấy, khi lượng (NH4)2SO4 ở mức giá trị biên –α, lượng L-lysine đạt 34g/L, mức trung tâm (0) đạt cao nhất 38g/L. Tuy nhiên, khi tăng yếu tố X2 lên mức giá trị biên +α thì lượng L-lysine giảm còn 34g/L. Hàm lượng (NH4)2SO4 cao trong canh trường không thích hợp cho chủng sản sinh L-lysine. Hàm lượng thích hợp là từ 1-4%. Bên cạnh đó, dịch bắp cũng là nguồn chứa nitơ nên làm tăng lượng nitơ trong canh trường.
Phương trình hồi quy cho thấy, ở dạng hàm bậc nhất, yếu tố X8 mang hệ số (- 0,1025), ảnh hưởng âm đến giá trị hàm mục tiêu. Còn ở dạng hàm bậc hai (X82) mang hệ số (+0,0003), ảnh hưởng dương đến hàm mục tiêu, tuy nhiên, hệ số này rất nhỏ nên không ảnh hưởng đáng kể đến giá trị hàm mục tiêu. Như vậy, nếu tăng lượng dịch bắp lên trên mức trung tâm sẽ làm giảm giá trị hàm mục tiêu. Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi lượng dịch bắp ở mức biên –α đã thu được sản lượng L-lysine cao nhất, đạt 38g/L (thí nghiệm 11). Khi tăng lượng dịch bắp lên mức giá trị biên +α thì lượng L-lysine trong canh trường giảm, thấp hơn so với mức trung tâm và mức (-1) (thí nghiệm 4). Dịch bắp là nguồn nguyên liệu chứa nhiều thành phần: carbon, nitơ, biotine, thiamine, muối khoáng và một số amino acid. Một lượng vừa đủ sẽ thúc đẩy quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm của chủng giống, nâng cao năng suất. Tuy nhiên, hàm lượng cao các thành phần này trong dịch lên men có thể gây tác dụng ngược lại, làm ức chế quá trình sinh trưởng và sinh L-lysine của chủng thông qua việc gây ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của màng tế bào và hoạt động của các enzyme ngoại bào.
Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp lên lượng L-lysine được thể hiện qua đồ thị đường mức hình 3.2.
Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể hiện sự ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp lên lượng L-lysine
Qua đồ thị ta thấy, giá trị tối ưu của hàm mục tiêu lớn hơn 38g/L tương ứng với vùng màu xanh đậm phía ngoài cùng.
Tuy nhiên, để xác định chính xác cực trị hàm mục tiêu, ta dựa vào đồ thị tối ưu trong hình 3.3. (NH4)2SO4 D ic h ch ie t ba p 40 35 30 25 20 150 125 100 75 50 > – – – < 32 32 34 34 36 36 38 38 Lysine_CCD
Contour Plot of Lysine_CCD vs Dich chiet bap, (NH4)2SO4
(NH4)2SO4
Hình 3.3 Đồ thị tối ưu
Đồ thị cho thấy, cực trị hàm mục tiêu đạt 39,6881g/L khi (NH4)2SO4 ở mức giá trị biên –α, tương đương 15,8579g/L và dịch bắp cũng ở mức giá trị biên –α, tương đương 29,2893 mL/L.
Như vậy, thông số tối ưu của 2 yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu, đó là (NH4)2SO4 15,8579g/L và dịch bắp 29,2893 mL/L. Các yếu tố còn lại bố trí ở mức trung tâm, bao gồm: glucose 50g/L, KH2PO4 1g/L, hỗn hợp muối khoáng 5mL/L, biotine 20µg/L, thiamine 150µg/L, tween 20 5mL/L. Sau 48 giờ lên men, lượng L-lysine thu được theo lý thuyết là 39,6881g/L. Tiến hành thực nghiệm để đánh giá, lượng L-lysine đạt 34g/L sau cùng thời gian lên men, chênh lệch không nhiều so với lý thuyết.
Tóm lại, bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được thông số tối ưu môi trường lên men chủng bao gồm các thành phần sau: (NH4)2SO4 15,8579g/L, dịch bắp 29,2893mL/L, glucose 50g/L, KH2PO4 1g/L, hỗn hợp muối khoáng 5mL/L, biotine 20µg/L, thiamine 150µg/L, tween 20 5mL/L. Sau 48 giờ lên men, lượng L-lysine đạt 34g/L. Trên môi trường này, tiến hành thử nghiệm lên men fed-batch nhằm nâng cao năng suất thu nhận L-lysine.