2.3.1. Phương pháp vi sinh
2.3.1.1. Kiểm tra hình thái vi sinh vật
Quan sát đại thể: cấy trang, cấy ria vi khuẩn trên thạch đĩa để quan sát đặc điểm hình thái và màu sắc khuẩn lạc.
Quan sát vi thể: nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 100x. Dùng que cấy ria lấy một lượng giống vừa đủ đặt lên lam kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn đến khi khô. Phủ hoàn toàn lên mẫu bằng thuốc nhuộm crystal violet (tím), để 30 giây, rửa nhẹ nhàng bằng nước cất. Tiếp theo, phủ lên mẫu dung dịch Iot, để 30 giây, rửa lại bằng nước cất. Rửa mẫu với cồn 700, tuy nhiên, không nên để cồn tiếp xúc với mẫu quá 5 giây vì cồn có thể khử toàn bộ màu. Rửa lại mẫu với nước cất rồi phủ lên mẫu thuốc nhuộm fuchsin (hồng), để
trong 30 giây. Rửa mẫu bằng nước cất một lần nữa. Dùng giấy thấm khô lam kính, nhỏ một giọt dầu soi kính lên mẫu và quan sát ở vật kính 100X.
2.3.1.2. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch
Nguyên tắc: mỗi tế bào vi khuẩn phân chia hình thành một khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa tương đương với lượng tế bào vi khuẩn sống trong dịch lên men.
Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ khác nhau (10-1 – 10-7), hút 0,1mL ở 3 nồng độ: 10-5, 10-6, 10-7 cấy trang lên thạch đĩa (lặp lại 3 lần). Ủ ở nhiệt độ 300C trong 24h, đếm khuẩn lạc. Tính số tế bào vi khuẩn/mL theo công thức:
Số khuẩn lạc/mL = Trong đó:
a là số khuẩn lạc ở đĩa thứ nhất b là số khuẩn lạc ở đĩa thứ 2 c là số khuẩn lạc ở đĩa thứ 3
10-n là nồng độ pha loãng huyền phù tế bào
(số khuẩn lạc chấp nhận được phải nằm trong khoảng 50-150 khuẩn lạc/đĩa).
2.3.1.3. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang
Dựa vào đường chuẩn sinh khối và độ đục huyền phù tế bào để xác định mật độ tế bào/mL.
Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở những nồng độ thích hợp sao cho chỉ số OD nằm trong giới hạn OD đường chuẩn. Thế giá trị OD của từng mẫu dịch huyền phù vào phương trình đường chuẩn sinh khối. Ghi nhận kết quả.
2.3.1.4. Xác định Gram bằng phản ứng String Test
Nguyên tắc: phản ứng string test dựa trên sự khác nhau về cấu trúc hóa học của vách tế bào. Vách tế bào vi khuẩn Gram (-) dễ bị vỡ khi tiếp xúc với dung dịch kiềm do vách peptidoglycan mỏng. Phản ứng string test bước đầu giúp phân biệt vi khuẩn Gram (-) và Gram (+).
x 10 10-n
3 a+b+c
Tiến hành: nhỏ một giọt KOH 3% lên lam kính. Dùng que cấy ria chấm khuẩn lạc
Corynebacterium glutamicum khuấy đều lên giọt KOH. Quan sát sự kéo sợi trong 60 giây. Phản ứng dương tính thì kết luận là Gram (+), phản ứng âm tính thì kết luận là Gram (-).
2.3.1.5. Xác định vi khuẩn hiếu khí nhờ H2O2
Nguyên tắc: hầu hết các vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các hợp chất có độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 (hydroxygen peroxide) thành H2O và O2 gây hiện tượng sủi bọt khí.
Tiến hành: nhỏ một giọt H2O2 lên lam kính. Dùng que cấy chấm khuẩn lạc
Corynebacterium glutamicum lên giọt H2O2. Quan sát sự sủi bọt khí, phản ứng dương tính là hiếu khí, âm tính là kỵ khí.
2.3.2. Phương pháp hóa sinh
2.3.2.1. Định lượng amino acid L-lysine bằng phương pháp đo mật độ quang
L-lysine được định lượng theo phương pháp của Chung Lung Hsieh (1995) [19]. Nguyên tắc: Thuốc thử ninhydrin phản ứng cao với L-lysine ở pH =1. Ion sắt sẽ hạn chế sự phản ứng của ninhydrin với proline, nithine, glycine, arginine và histidine. Chinard (1952) thấy rằng ninhydrin phản ứng cao và có khả năng chọn lysine, proline, nithine ở pH =1. Bổ sung ion sắt sẽ hạn chế phản ứng của ninhydrin với proline ở pH=1, tăng độ nhạy cảm của ninhydrin với lysine. Phương pháp này có thể sử dụng để định lượng mẫu lysine không cần pha loãng. Dimethyl sulfoxide bổ sung vào để hòa tan phức hợp ninhydrin – lysine, tăng phản ứng của thuốc thử ninhydrin với lysine.
Chuẩn bị hóa chất: FeCl3 50% (w/v), KCl 0,1M, HCl 1N, dung dịch DMSO (Demethyl Sulfoxide), dung dịch methyl cellosolve, ninhydrin.
Pha dung dịch:
Dung dịch A gồm: methyl cellosolve 46,625 mL, FeCl3 50% 3,75mL, KCl 0,1M 75mL, điều chỉnh pH=1 bằng HCl 1N.
Dung dịch B gồm: ninhydrin 0,5g, KCl 0,1M 50mL, điều chỉnh pH =1 bằng HCl 1N.
Phản ứng: hút 20µL dịch lên men đã ly tâm (13000 vòng/10 phút) vào ống nghiệm sạch, bổ sung 660µL dung dịch A và 370µL dung dịch B. Lắc đều, đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy trong 20 phút. Sau đó làm lạnh các ống nghiệm dưới vòi nước. Bổ sung thêm 4mL dung dịch DMSO và 6mL nước cất. Lắc đều và đo ở bước sóng 470nm.
2.3.2.2. Định lượng đường khử bằng DNS (3,5 dinitrosalicylic acid)
Nguyên tắc: nhờ đặc tính khử của đường, DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
Tiến hành: dịch lên men ly tâm loại bỏ sinh khối, pha loãng ở nồng độ thích hợp. Hút 3mL dịch vào ống nghiệm, sau đó bổ sung 1mL thuốc thử DNS. Đậy kín miệng ống nghiệm và đun cách thủy ở 1000C trong 5 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng, đo mật độ quang ở bước sóng 560nm.
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Minitab 16 để bố trí thí nghiệm và phân tích kết quả thí nghiệm tối ưu. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống
Trong nghiên cứu vi sinh, giống là một trong những yếu tố quan trọng. Đề tài này, chúng tôi sử dụng chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ Trung tâm lưu giữ giống vi sinh vật Đại học Quốc Gia Hà Nội. Đây là chủng tự nhiên đã được sàng lọc để sản xuất L-lysine.
Khảo sát đặc điểm đại thể, vi thể, sinh lý, sinh hóa của Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 làm tiền đề cho các thí nghiệm sau được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632
Đại thể Kích thước 1-1,5mm Hình dạng Tròn đầy, trơn bóng Màu sắc Vàng nhạt Vi thể Kích thước 1x1,5µm Hình dạng Que ngắn
Cách sắp xếp tế bào Hình chữ V hoặc song song Bào tử Không hình thành bào tử
Gram Dương (+)
Sinh lý, sinh hóa
Catalase Có enzyme catalase
Glucose + Sucrose + Fructose + Maltose + Ethanol + Acid acetic + Dịch bắp + Rỉ đường + Urê + (NH4)2SO4 + Peptone + (+): có khả năng đồng hóa.
(a) (b)
Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) và hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b).
Những khảo sát tiền đề cho thấy, chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (+). Dưới kính hiển vi ở vật kính 100X, quan sát thấy tế bào có dạng que ngắn, xếp hình chữ V hoặc song song, bắt màu tím của thuốc nhuộm crystal. Tuy nhiên, chủng là vi khuẩn Gram biến đổi nên khi tế bào già chuyển sang Gram âm (-), bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin.
Trên môi trường thạch đĩa, khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu vàng nhạt, trơn bóng, kích thước 1-1,5 mm sau một ngày nuôi cấy.
Chủng có khả năng đồng hóa nhiều nguồn carbon như glucose, sucrose, fructose, maltose…và một số nguồn carbon tự nhiên như dịch bắp, rỉ đường do trong hệ gen có những gen tham gia tổng hợp enzyme phân giải những nguồn carbon này [13, 35].
Urê, peptone và (NH4)2SO4 là những nguồn nitơ phổ biến được đưa vào môi trường lên men chủng thu nhận L-lysine. NH4+ là nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất. Urê được phân giải thành NH3 và CO2 nhờ enzyme urease. Peptone là nguồn nitơ hữu cơ, nhờ hoạt động của enzyme deaminase biến đổi thành NH3. NH3 xâm nhập qua thành tế bào và tham gia vào quá trình hình thành amino acid [4].
3.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-
lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 3.2.1. Thí nghiệm sàng lọc
Trong quá trình lên men thu nhận L-lysine, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine của chủng. Trong đó, môi trường lên men có ảnh hưởng trực tiếp. Tuy nhiên, không phải tất cả các thành phần trong môi trường lên men đều có ảnh hưởng như nhau đến lượng L-lysine. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sàng lọc để tìm ra những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu là lượng L-lysine. Kết quả thí nghiệm sàng lọc thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc TN X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Y (L-lysine ) 1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 34,296 2 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 24,508 3 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 35,284 4 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 34,316 5 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 26,836 6 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 32,25 7 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 24,79 8 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 27,41 9 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 24,34 10 1 -1 -1 1 1 1 1 -1 25,16 11 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 33,89 12 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 26,37
Từ bảng kết quả cho thấy, ở thí nghiệm thứ 3, glucose (-), biotine (-), dịch bắp (+), cho lượng L-lysine cao nhất, đạt 35,284g/L. Thí nghiệm thứ 9, muối khoáng (+), các yếu tố còn lại ở mức (-) cho lượng L-lysine thấp nhất, đạt 24,34g/L trong cùng điều kiện và thời gian lên men (48 giờ). Để đánh giá chính xác ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm mục tiêu, tiến hành phân tích hồi quy-phương sai.
Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát
Các yếu tố khảo sát Ký hiệu Mức ảnh hưởng Giá trị P
Glucose X1 3,3257 0,066 (NH4)2SO4 X2 5,2223 0,021 KH2PO4 X3 -0,9983 0,458 Hỗn hợp muối khoáng X4 -1,6937 0,245 Biotin X5 -1,7683 0,229 Thiamin X6 -0,4717 0,715 Tween 20 X7 1,2590 0,362 Dịch bắp X8 4,6463 0,029
Giá trị P là giá trị xác suất thống kê về mức độ quan trọng của từng yếu tố thí nghiệm đối với hàm mục tiêu. Những yếu tố có giá trị P tương ứng nhỏ hơn mức ý nghĩa α (α = 0,05) là những yếu tố có ý nghĩa thống kê về mức độ ảnh hưởng. Nói cách khác, yếu tố có giá trị P <α thì ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu, và ngược lại.
Quan sát cột giá trị P trong bảng 3.3 cho thấy, yếu tố X2 và X8 là hai yếu tố có giá trị P tương ứng nhỏ hơn 0,05, chứng tỏ đây là hai yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu. Các yếu tố còn lại có giá trị P lớn hơn nhiều so với mức ý nghĩa α, cho thấy các yếu tố này không gây ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu.
Độ lớn của các hệ số ảnh hưởng (hay giá trị tuyệt đối của các hệ số) cho biết mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đối với hàm mục tiêu. Dấu (+) hay (-) của hệ số cho biết tác động của yếu tố đối với hàm mục tiêu là dương hay âm. Dấu (+) biểu thị sự tác động dương, dấu (-) biểu thị sự tác động âm. Nghĩa là, những yếu tố có hệ số ảnh hưởng (+) nếu được nhận giá trị cao hơn mức trung tâm sẽ làm tăng giá trị hàm mục tiêu. Tương tự, những yếu tố có hệ số ảnh hưởng (-) nếu được nhận giá trị cao hơn mức trung tâm sẽ làm giảm giá trị hàm mục tiêu.
Hệ số ảnh hưởng của yếu tố X2 và X8 có giá trị lớn nhất trong 8 yếu tố khảo sát và đều mang giá trị (+) cho thấy, nếu hai yếu tố này nhận được giá trị cao hơn mức trung tâm thì sẽ làm tăng giá trị hàm mục tiêu. Chứng tỏ, lượng L-lysine phụ thuộc lớn vào
hai yếu tố này. Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2 (R-Sq) = 94,32% chứng tỏ mô hình tìm được khá phù hợp với dữ liệu.
Như vậy, qua sàng lọc, chúng tôi xác định được hai yếu tố có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng giống, đó là (NH4)2SO4 và dịch bắp. Trên cơ sở này, tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình và các thông số thí nghiệm.
3.2.2. Thí nghiệm khởi đầu
Sau khi sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu, tiếp tục tiến hành một số thí nghiệm với các yếu tố này, có bổ sung 5 thí nghiệm ở mức trung tâm. Giá trị trung tâm cho phép đánh giá mức độ phù hợp (Lack of fit) của mô hình hồi quy bậc nhất đã xây dựng. Đây là thông tin quan trọng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả thí nghiệm khởi đầu được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khởi đầu
TN (NH4)2SO4 Dịch bắp Y (L-lysine g/L) 1 -1 -1 37,69 2 0 0 33,20 3 0 0 33 4 -1 1 32 5 0 0 33,80 6 1 1 32,59 7 1 -1 36,80 8 0 0 33,70 9 0 0 33,50
Kết quả thí nghiệm cho thấy, lượng L-lysine đạt cao nhất 37,69g/L khi hai yếu tố ảnh hưởng được bố trí ở dưới mức trung tâm (thí nghiệm 1). Tuy nhiên, lượng L-lysine sẽ giảm còn 32g/L nếu tăng lượng dịch bắp lên trên mức trung tâm (thí nghiệm 4).
Thông số quan trọng để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình hồi quy là giá trị P của “Lack of fit”. Nếu giá trị P của “Lack of fit” lớn hơn mức ý nghĩa α thì chấp nhận
mô hình hồi quy bậc nhất, nghĩa là hàm mục tiêu còn xa vùng cực trị. Ngược lại, nếu giá trị P nhỏ hơn α thì mô hình hồi quy bậc nhất không được chấp nhận, nghĩa là hàm mục tiêu được mô tả bằng mô hình hồi quy bậc cao hơn.
Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu
Chỉ tiêu Giá trị P Lack of fit Main Effects Ct Pt Curvature 0,003 0 0,007 0,007 r2 (R-Sq) = 96,61%
Phân tích hồi quy-phương sai thu được giá trị P của “Lack of fit” là 0,003, nhỏ hơn nhiều so với mức ý nghĩa α, điều này nghĩa là mô hình hồi quy bậc nhất không phù hợp. Các ảnh hưởng chính (Main Effects) có giá trị P bằng 0 chứng tỏ các yếu tố ảnh hưởng chính có ý nghĩa về mặt thống kê. Giá trị P của các điểm trung tâm (Ct Pt) là 0,007; nhỏ hơn α chứng tỏ các điểm trung tâm có ảnh hưởng đáng kể đến mô hình hồi quy. Giá trị P của “Curvature” (đường cong) bằng 0,007, nhỏ hơn nhiều so với α cho thấy khả năng xuất hiện dạng cong của bề mặt chỉ tiêu là rất lớn. Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2
(R-Sq) = 96,61% cho thấy mô hình tìm được khớp với số liệu thực nghiệm.
Để tìm chính xác điểm cực trị của hàm mục tiêu, cần tiến hành thêm các thí nghiệm mà ở đó, mỗi yếu tố phải được bố trí nhiều hơn 3 mức giá trị. Đây là cơ sở để tiến hành thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay (RSM-CCD).
3.2.3. Thí nghiệm bề mặt đáp ứng RSM-CCD
Thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay sẽ bổ sung thêm các điểm thí nghiệm nhằm xây dựng mô hình hồi quy bậc 2 mô tả hàm mục tiêu.
Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.5.
Từ bảng kết quả cho thấy, lượng L-lysine đạt cao nhất 38g/L (thí nghiệm 11) khi (NH4)2SO4 ở mức trung tâm và dịch bắp ở mức giá trị biên –α. Thí nghiệm 4, lượng L- lysine thu được thấp nhất (31g/L) khi (NH4)2SO4 ở mức trung tâm và dịch bắp ở mức giá trị biên +α.
Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD TN (NH4)2SO4 Dịch bắp Y (L-lysine g/L) 1 0 0 33,20 2 0 0 33 3 0 0 33,80 4 0 +1,41 31,31 5 -1 1 32,37 6 0 0 33,70 7 0 0 33,50 8 -1,41 0 34,88 9 -1 -1 37,32 10 1 -1 37,17 11 0 -1,41 38,24 12 +1,41 0 34,67