glutamicum
1.3.5.1. Thiết kế môi trường lên men
Thiết kế môi trường lên men là bước rất quan trọng quyết định sự thành công trong lên men vi sinh vật. Thành phần môi trường phải đảm bảo đủ lượng để phục vụ cho việc tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp đủ năng lượng cho việc duy trì mật độ tế bào cũng như sinh tổng hợp. Môi trường lên men được thiết kế tùy thuộc vào yêu cầu của chủng vi sinh vật, phương pháp lên men và sản phẩm mục tiêu.
Phương trình cân bằng vật chất trong lên men được thể hiện như sau:
C + N + O2 + các yếu tố khác = sinh khối + sản phẩm + CO2 + H2O + nhiệt Thành phần môi trường bao gồm các yếu tố đa lượng (C, N) và các yếu tố vi lượng (muối khoáng, vitamine, chất kiểm soát…).
Dựa vào thành phần và hàm lượng các chất trong tế bào vi sinh vật để thiết kế thành phần môi trường lên men. Trong tế bào vi sinh vật, C chiếm khoảng 50% trọng lượng khô của tế bào. Các nguyên tố C, N, H, O chiếm tổng cộng khoảng 92%, còn lại là các yếu tố vi lượng [2]. Những yếu tố có hàm lượng cao là những yếu tố ảnh hưởng
lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Vì vậy trong môi trường lên men, hàm lượng C, N thường cao hơn rất nhiều so với các nguyên tố vi lượng.
1.3.5.2. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên men
Nước: tế bào vi sinh vật chứa 70% là nước [2], mọi hoạt động sống của vi sinh vật như đồng hóa, dị hóa đều diễn ra trong môi trường nước. Do vậy, nước là yếu tố quan trọng không thể thiếu trong các quá trình lên men. Ngoài ra, nước còn cần thiết cho những hoạt động khác trong quá trình lên men như: gia nhiệt, giải nhiệt…Nước sử dụng trong môi trường lên men phải là nước đã được loại bỏ hoàn toàn các ion khoáng để không làm thay đổi hàm lượng khoáng trong môi trường lên men.
Nguồn carbon: carbon có ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối, các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp của vi sinh vật. Sản xuất L-lysine bởi Corynebacterium glutamicum ở quy mô phòng thí nghiệm, nguồn carbon được chọn thường tinh khiết (glucose), nhưng trong sản xuất công nghiệp thường dùng nguồn carbon rẻ tiền có nguồn gốc tự nhiên như: bột ngô, bột ngũ cốc, mật rỉ đường mía hoặc củ cải. Những nguồn carbon này chứa nhiều tạp chất nên cần chế biến loại bỏ các thành phần tạp chất có ảnh hưởng không tốt đến vi sinh vật trước khi đưa vào sử dụng. Khi khử trùng môi trường lên men cần tách riêng nguồn đường khử và nguồn nitơ hữu cơ vì phân tử đường glucose sẽ dễ dàng phản ứng với gốc –NH2 trong amino acid (phản ứng caramen hóa) tạo ra hợp chất có màu nâu đen, gây ức chế sinh trưởng tế bào.
Nguồn nitơ: nitơ có vai trò quan trọng trong giai đoạn hình thành sinh khối, tham gia vào nhiều cấu trúc tế bào. Ở quy mô phòng thí nghiệm, nguồn nitơ vô cơ được lấy từ các muối ammonium, muối nitrate, nitrite, nitơ hữu cơ được lấy từ cao nấm men, peptone, dịch chiết bắp…Trong đó, dịch bắp là nguồn cung cấp carbon, nitơ và các amino acid nên thường được dùng trong công nghiệp. Đối với chủng Corynebacterium glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng methionine và threonine, người ta sử dụng dịch thủy phân đậu nành để bổ sung methionine và threonine thay vì nguyên liệu tinh khiết, đắt tiền.
Các nguyên tố vi lượng: các nguyên tố vi lượng được sử dụng với hàm lượng vô cùng ít trong môi trường lên men nhưng lại có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật, vì tham gia vào cấu trúc một số enzyme hô hấp (Cu, Fe), hoạt hóa nhiều enzyme (Mn). Zn
tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme như DNA polymerase, RNA polymerase, nối các tiểu đơn vị protein trong việc hình thành cấu trúc đặc biệt cho hoạt động của enzyme. Photpho là một trong những nguyên tố khoáng quan trọng vì tham gia vào liên kết cao năng lượng và vận chuyển glucose qua màng tế bào [4].
pH: ion H+ trong môi trường lên men có thể làm thay đổi trạng thái điện tích của tế bào, làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với một số ion nhất định và gây ức chế các enzyme có mặt trên màng tế bào. pH 7,0 là điều kiện tối ưu nhất để
Corynebacterium glutamicum sản sinh L-lysine [7], vì thế, môi trường nuôi cấy cần được duy trì ở mức pH này. Việc bổ sung CaCO3 sẽ giúp pH môi trường ổn định. Khi pH giảm, gốc -CO3 bị phân hủy để hiệu chỉnh pH ổn định. Ngoài ra, việc bổ sung CaCO3 vào môi trường lên men còn có vai trò đối với khả năng thẩm thấu của tế bào.
Lượng oxy: oxy là chất nhận H+
cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Oxy có thể được cung cấp bằng cách lắc đảo bình lên men, khuấy trộn hoặc dẫn khí vô trùng vào bình lên men. Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn hiếu khí, vì vậy, việc cung cấp oxy với nồng độ thích hợp là yếu tố quan trọng quyết định năng suất L-lysine.
1.3.5.3. Những yếu tố cần kiểm soát trong lên men fed-batch
Kiểm soát pH: trong quá trình lên men, pH môi trường có thể giảm do sự có mặt của các sản phẩm trao đổi chất được sinh ra. Vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi pH môi trường nên cần phải kiểm soát pH trong suốt quá trinh lên men để đảm bảo mọi hoạt động sinh lý trong tế bào diễn ra bình thường. pH tối thích của môi trường là pH tối thích cho hệ enzyme của chủng nuôi cấy. Trong lên men fed-batch sản xuất amino acid, dung dịch ammoniac NH3 thường được chọn để hiệu chỉnh pH vì khi bổ sung vào canh trường không những đưa pH về mức ban đầu mà còn là nguồn cung cấp nitơ cho vi khuẩn. Trong lên men công nghiệp, người ta sử dụng hệ thống kiểm soát pH tự động.
Kiểm soát lượng oxy hòa tan: đối với lên men thu nhận amino acid, nếu sự thiếu oxy xảy ra trong pha log sẽ hình thành nên các sản phẩm phụ như acid lactic gây ảnh hưởng đến hiệu suất lên men, đồng thời gây ức chế, ảnh hưởng đến hoạt tính của chủng. Vì vậy cần phải sục khí, khuấy trộn để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho hô hấp của chủng nghiên cứu.
Kiểm soát tốc độ bổ sung cơ chất: nồng độ cơ chất là yếu tố quan trọng trong lên men fed-batch. Vì vậy cần phải kiểm soát nồng độ cơ chất trong nồi lên men không quá cao cũng không quá thấp. Có thể bổ sung cơ chất theo kiểu liên tục hoặc gián đoạn.
Kiểm soát sự tạo bọt: trong điều kiện lên men có sục khí, lắc đảo hoặc sử dụng mật rỉ đường thường gây hiện tượng tạo bọt. Bọt tách tế bào vi khuẩn ra khỏi dịch lên men làm giảm sinh khối, tế bào không được tiếp xúc với điều kiện dinh dưỡng nên giảm hoạt tính ảnh hưởng đến năng suất lên men. Để kiểm soát bọt, có thể dùng phương pháp hóa học hoặc cơ học. Nghiên cứu này sử dụng Tween 20 để kiểm soát sự tạo bọt trong bình lên men.