3.3.1. Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất
Trên môi trường tối ưu, tiến hành lên men dạng batch. Chất lượng giống bổ sung vào môi trường lên men là 2,4 tỷ tế bào/mL. Lượng giống bổ sung là 7%. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua các đồ thị trong hình 3.4.
Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong lên men batch
Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine
Trên môi trường tối ưu, chủng thể hiện khả năng tăng sinh mạnh. Pha lag bắt đầu từ 0 giờ đến 5 giờ, tế bào tăng trưởng chậm do đây là giai đoạn thích nghi, cảm ứng một số enzyme để chuẩn bị bước vào pha tăng trưởng. Giai đoạn này, L-lysine đã bắt đầu được hình thành.
Sau 5 giờ, tế bào bước vào pha tăng trưởng, trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ, mật độ tế bào tăng nhanh. Mật độ tế bào tăng vọt từ 6,3 Log CFU/mL thời điểm 5 giờ lên 9,13 Log CFU/mL ở thời điểm 20 giờ. Giai đoạn này, chủng sử dụng cơ chất cho sự hình
5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 0 20 40 60 Mật độ tế bào Log CFU/mL
Thời gian (giờ) g/L Đường sót (g/L) Lysine (g/L) Mật độ TB (log CFU/mL)
thành sinh khối và tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, trong đó có L-lysine. L-lysine tiếp tục tăng tuyến tính theo thời gian. Lượng đường giảm nhanh, chỉ còn 30g/L ở thời điểm 20 giờ.
Qua 20 giờ, tế bào bước vào pha cân bằng, mật độ tế bào không tăng do lượng tế bào sinh ra bằng lượng tế bào chết đi. Cơ chất lúc này được sử dụng cho sự hình thành sản phẩm. L-lysine vẫn tăng cho đến 48 giờ, đạt 34g/L. Tuy nhiên, ở thời điểm 32 giờ trở đi, lượng đường sót trong canh trường còn ít. Đến 48 giờ, lượng đường chỉ còn 10g/L nên lượng L-lysine trong giai đoạn này tăng rất chậm (2g/L). Vì thế, thời điểm 32 giờ là thích hợp cho ngừng lên men thu sản phẩm. Kéo dài thời gian lên men, lượng L- lysine sinh ra không đáng kể mà lại tốn thêm chi phí, tính về mặt kinh tế không mang lại hiệu quả.
Qua 40 giờ, tế bào bước vào pha suy vong. Lượng cơ chất cạn kiệt, một số sản phẩm sinh ra trong quá trình trao đổi chất (acid) gây độc cho tế bào, gây hiện tượng chết tế bào, làm giảm mật độ tế bào.
Lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine được nghiên cứu khá nhiều trong và ngoài nước. Công trình nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài như Jong W. Oh (1993) [11], Hadj Sassi (1988) [15] cho sản lượng L-lysine xấp xỉ 30g/L. Một số tác giả trong nước như Hồ Sưởng (1980-1985), Nguyễn Thùy Châu (2006) [1], Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Minh Tâm (2009) [7] nghiên cứu lên men trên
Corynebacterium glutamicumcũng cho sản lượng tương tự.
Dựa vào lượng đường sót trong canh trường, tiến hành tính toán khả năng sử dụng đường của chủng giống, trên cơ sở này, tính toán lượng đường bổ sung từng giai đoạn trong lên men fed-batch.
Bảng 3.7 Khả năng sử dụng đường của chủng trong lên men batch Thời gian khảo sát
(giờ) Đường sót (g/L) Khả năng sử dụng đường (g/L/giờ) 0 59,1 2 57,2 0,95 4 55,4 0,9 5 52 3,4 6 51 1 8 48,7 1,15 12 47,6 0,3 16 43,3 1,1 20 31,3 3 24 25,5 1,5 28 19,9 1,4 32 16,8 0,78 36 15,2 0,4 40 15 0,1 44 12,7 0,58 48 10,9 0,45
Qua bảng 3.6 ta thấy, lượng đường sót trong canh trường giảm theo thời gian do chủng sử dụng để tăng sinh khối và hình thành các sản phẩm trao đổi chất. Tuy nhiên, khả năng sử dụng đường ở mỗi giai đoạn khác nhau không giống nhau.
Khả năng sử dụng đường từng giai đoạn của chủng được tính như sau: [đường sót (t2) – đường sót (t1)]/ (t2 – t1)
Trong đó, t1, t2 là thời điểm khảo sát.
Thời điểm 20 giờ là thời điểm cuối pha tăng trưởng, đầu pha cân bằng, lượng đường trong canh trường chỉ còn 30g/L. Đồng thời, đây cũng là giai đoạn chủng sinh tổng hợp L-lysine nên chúng tôi chọn thời điểm 20 giờ là thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất.
Với hình thức fed-batch gián đoạn, chúng tôi chọn chu kỳ bổ sung cơ chất là 2 giờ để phù hợp với công việc trong phòng thí nghiệm.
Chúng tôi chọn glucose là nguồn cơ chất bổ sung trong lên men fed-batch. Do cấu tạo phân tử đơn giản, glucose là nguồn đường dễ sử dụng nhất, được vi sinh vật đồng hóa đầu tiên khi vào môi trường nội bào. Các nguồn đường khác như sucrose, maltose…phải được biến đổi thành glucose nhờ các enzyme đặc hiệu được mã hóa bởi các gen tương ứng trong hệ gen của vi khuẩn rồi mới được đồng hóa. Ngoài ra, đây là nguồn carbon tinh nên dễ dàng kiểm soát lượng đường trong canh trường. Việc sử dụng rỉ đường hay dịch bắp có thể cho sản lượng L-lysine cao hơn nhưng đây là hai nguồn nguyên liệu chứa nhiều thành phần và có tạp chất nên khó kiểm soát hàm lượng các chất dinh dưỡng trong quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để so sánh khả năng hình thành L-lysine của glucose với các đường khác. Kết quả, glucose cho sản lượng cao hơn. Tác giả Tobias Georgi (2005) đã nuôi cấy Corynebacterium glutamicum
thu L-lysine trên ba nguồn cơ chất: glucose, fructose và sucrose. Tác giả thu được lượng L-lysine cao hơn trên môi trường glucose [13]. Kiefer (2002) cũng thu được kết quả tương tự khi nuôi cấy Corynebacterium glutamicum trên các nguồn đường này [20].
Căn cứ vào khả năng sử dụng đường của chủng (bảng 3.6), chúng tôi xác định lượng đường cần bổ sung từng giai đoạn trong lên men fed-batch (Phụ lục 9). Tuy nhiên, từ thời điểm 20 giờ, khả năng sử dụng đường của chủng giảm nên chúng tôi chọn nồng độ dịch glucose bổ sung là 25%.
Tóm lại, lên men batch chủng Corynebacterium glutamicum -B-0632 thu nhận L- lysine, chúng tôi thu được một số kết quả như sau:
• Thời điểm sinh khối cao nhất: 20 giờ • Thời điểm thu L-lysine: 32 giờ
• Thời điểm bắt đầu bổ sung glucose cho lên men fed-batch: 20 giờ
•Chu kỳ bổ sung cơ chất: 2 giờ