2.3.2.1. Định lượng amino acid L-lysine bằng phương pháp đo mật độ quang
L-lysine được định lượng theo phương pháp của Chung Lung Hsieh (1995) [19]. Nguyên tắc: Thuốc thử ninhydrin phản ứng cao với L-lysine ở pH =1. Ion sắt sẽ hạn chế sự phản ứng của ninhydrin với proline, nithine, glycine, arginine và histidine. Chinard (1952) thấy rằng ninhydrin phản ứng cao và có khả năng chọn lysine, proline, nithine ở pH =1. Bổ sung ion sắt sẽ hạn chế phản ứng của ninhydrin với proline ở pH=1, tăng độ nhạy cảm của ninhydrin với lysine. Phương pháp này có thể sử dụng để định lượng mẫu lysine không cần pha loãng. Dimethyl sulfoxide bổ sung vào để hòa tan phức hợp ninhydrin – lysine, tăng phản ứng của thuốc thử ninhydrin với lysine.
Chuẩn bị hóa chất: FeCl3 50% (w/v), KCl 0,1M, HCl 1N, dung dịch DMSO (Demethyl Sulfoxide), dung dịch methyl cellosolve, ninhydrin.
Pha dung dịch:
Dung dịch A gồm: methyl cellosolve 46,625 mL, FeCl3 50% 3,75mL, KCl 0,1M 75mL, điều chỉnh pH=1 bằng HCl 1N.
Dung dịch B gồm: ninhydrin 0,5g, KCl 0,1M 50mL, điều chỉnh pH =1 bằng HCl 1N.
Phản ứng: hút 20µL dịch lên men đã ly tâm (13000 vòng/10 phút) vào ống nghiệm sạch, bổ sung 660µL dung dịch A và 370µL dung dịch B. Lắc đều, đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy trong 20 phút. Sau đó làm lạnh các ống nghiệm dưới vòi nước. Bổ sung thêm 4mL dung dịch DMSO và 6mL nước cất. Lắc đều và đo ở bước sóng 470nm.
2.3.2.2. Định lượng đường khử bằng DNS (3,5 dinitrosalicylic acid)
Nguyên tắc: nhờ đặc tính khử của đường, DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
Tiến hành: dịch lên men ly tâm loại bỏ sinh khối, pha loãng ở nồng độ thích hợp. Hút 3mL dịch vào ống nghiệm, sau đó bổ sung 1mL thuốc thử DNS. Đậy kín miệng ống nghiệm và đun cách thủy ở 1000C trong 5 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng, đo mật độ quang ở bước sóng 560nm.