(Steyn, A.J.C. and Pretorius, 1992)
Tách chiết bộ gen xạ khuẩn theo quy trình của Qiagen
Nguyên tắc
Thành tế bào của XK được phá vỡ giúp ADN được giải phóng ra. Protein và ARN được tách ra khỏi ADN nhờ các loại ARN-aza,, proteaza và các loại dung môi thích hợp.
Cách tiến hành
vận tốc 220 vòng/phút. Sau 72 giờ, lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf. Li tâm 8000 vòng/phút, trong 5 phút thu sinh khối xạ khuẩn. Huyền phù sinh khối với 54% TE và 25 µl lysozyme nồng độ 5 mg/ml được ủ ở 370C, trong 30phút.
Cho 30 μl SDS 10% và 3 μl protein K 20 mg/ml, đảo đều. Ủ ở 370
C, trong 1 h Tiếp tục cho 800 μl chloroform vào hỗn hợp trên, lắc mạnh. Sau đó, tiến hành ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút để thu dịch nổi.
Cho phenol (bằng thể tích dịch nổi thu được), vortex, ly tâm, thu dịch nổi Cho phenol : chloroform (bằng thể tích dịch thu được), vortex, ly tâm, thu dịch nổi (thực hiện 2 lần)
Cho chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, vortex, ly tâm thu dịch trong (thực hiện 2 lần)
Cho 10 μl RNase (20 μg/ul), ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Cho 0,7 lần thể tích Isopropanol
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa Rửa tủa bằng 500 μl ethanol 70%. Bảo quản -20 o
C.
Khuếch đại trình tự ARNr 16S
Sử dụng cặp mồi có trình tự như sau để khuếch đại vùng ARNr 16S của xạ khuẩn:
Mồi xuôi: 27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
Mồi ngược: 1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT’-3’
Thành phần của phản ứng PCR thu gen được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR Nước 77,5 µl dNTP 10 µl Buffer 10 µl 27F (100 pmol) 0,25 µl 1492R (100 pmol) 0,25 µl Template (500 ng/µl) 1 ul Enzyme (10U/µl) 1 µl Tổng thể tích 100 µl
Chu trình nhiệt
Tinh chế sản phẩm PCR
Sản phẩm khuếch đại được tinh chế bằng bộ kít QIAquick PCR Purification
Quy trình thực hiện:
Hỗn hợp sản phẩm được cho vào một eppendorf 1,5 ml
Bổ sung buffer PB với tỉ lệ 5:1 (v/v) so với thể tích sản phẩm PCR, trộn đều Chuyển dung dịch vào cột tinh chế. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 – 60 giây, đổ bỏ dịch sau khi qua cột
Bổ sung 750 µl buffer PE vào cột để rửa. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 – 60 giây, đổ bỏ phần dịch sau khi qua cột
Ly tâm lại 9000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn buffer PE Chuyển cột sang một eppendorf 1,5 ml mới
Bổ sung 30 – 50 µl Buffer EB (10mM Tris-HCl, pH 8,5) hay Mili Q vào chính giữa cột, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút, thu phần dịch chứa gen và ở nhiệt độ - 20oC.
Giải trình tự ARNr 16S
Sản phẩm khuếch đại sau khi tinh chế được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc).
Định danh chủng xạ khuẩn dựa vào trình tự ARNr 16S
Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit. Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST. Từ đó xác định tên loài của chủng nghiên cứu.
95°C 95°C 55°C 72°C 72°C 4°C 5 phút 30 giây 30 giây A phút 5 phút ∞ 1 2 x 30 chu kỳ 3