Lấy mẫu
Sử dụng dụng cụ vô trùng gạt bỏ 5 cm lớp đất mặt và tiến hành lấy đất sâu 5cm. Đựng mẫu trong túi nilon, buộc kín miệng, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, thời
gian lấy mẫu. Bảo quản mẫu trong thùng xốp chứa nước đá được vận chuyển về phòng thí nghiệm và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C.
Phân lập XK bằng phương pháp sấy khô (Nonomura et al, 1969)
Nguyên tắc
- Tách rời các tế bào XK.
- Nuôi cấy các tế bào trên môi trường đặc trưng để tạo ra KL riêng rẽ, cách biệt nhau.
Cách tiến hành
- Các mẫu đất được làm khô ở nhiệt độ phòng trong 5 – 7 ngày, rồi xử lý ở nhiệt độ 90 – 1100
C trong 10 – 30 phút để loại bỏ các VK không sinh BT (hầu hết các bào tử XK không chết ở điều kiện này).
- Cân 1g đất cho vào bình tam giác 250 ml chứa 99 ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút sẽ được độ pha loãng là 1/100. Để có độ pha loãng là 1/1000 lấy 1 ml của dung dịch có độ pha loãng là 1/100 cho vào ống nghiệm có 9 ml nước cất vô trùng. Tiếp tục tiến hành pha loãng đến nồng độ mong muốn.
- Từ dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-4 nhỏ 0,1 ml lên bề mặt môi trường Gauze – 1 đã chuẩn bị sẵn trong các hộp Petri. Dùng que gạt vô trùng trang đều dịch huyền phù trên mặt môi trường cho 3 hộp, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 7 - 14 ngày mang các hộp Petri ra quan sát.
- Các KL với hình thái khác nhau được chọn và cấy truyền sang MT Gauze - 1 mới để thuần khiết lần thứ hai.
2.2.2. Bảo quản giống bằng dầu khoáng
Nguyên tắc:
- Đảm bảo tốt các điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm thay đổi bản chất ban đầu của giống.
- Làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV đồng thời ngăn cản sự sinh sản của chúng.
Cách tiến hành:
- Khử trùng dầu khoáng 20% bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 2 giờ. Sau đó, sấy khô ở 1700C trong 1 – 2 giờ, rồi để nguội.
- Cấy XK lên môi trường Guaze – 1 sau 14 ngày. Đổ lên bề mặt môi trường có XK phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm.
- Trét parafin đặc lên miệng ống nghiệm và giữ ở điều kiện lạnh (-200C).
2.2.3. Quan sát hình thái xạ khuẩn
Quan sát đại thể
Sử dụng que cấy đầu vuông vô trùng lấy một ít BT từ ống giống XK cho vào ống nghiệm chứa 5 ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi cấy chấm điểm vào giữa đĩa Petri.
Ủ đĩa Petri trong tủ ấm 7 – 14 ngày, sau đó lấy ra quan sát đặc điểm KL (kích thước, màu sắc, hình dạng tính chất khuẩn lạc XK, màu sắc môi trường,...).
Quan sát vi thể (phương pháp xẻ rãnh thạch của Okamia Suzuki, 1968)
Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp Petri, cấy dịch BT xạ khuẩn xung quanh mép rãnh.
Đặt 1 hoặc 2 lamelle vô trùng nghiêng 45° lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp đĩa Petri để vào tủ ấm 28 – 30°C.
Sau 7-14 ngày lấy lamelle ra khỏi đĩa Petri tiến hành nhuộm màu và quan sát hệ sợi, cuống sinh BT,... dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100.
2.2.4. Xác định khả năng kháng nấm của XK
Phương pháp khoan lỗ thạch
Nguyên tắc:
Nuôi cấy VSV đối kháng trên cùng một MT thạch, kiểm tra vòng kháng nấm, để xác định chủng XK sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium.
Cách tiến hành:
Bổ sung 2% (v/V) giống XK với mật độ 108 BT/ml vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường dịch thể, lắc 220 vòng/ phút trong 3-5 ngày. Sử dụng khoan nút chai vô trùng (d = 9mm) khoan lỗ trên đĩa môi trường PDA. Dùng que cấy vô trùng, cấy chấm điểm Fusarium(nuôi 3 ngày trên môi trường PDA) vào 2 phía đối diện của lỗ thạch. Sau đó, dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch nuôi cấy XK nhỏ vào lỗ thạch mới khoan. Đậy nắp hộp Petri để ở nhiệt độ phòng, sau 3-5 ngày tiến hành
kiểm tra kết quả. Nếu XK có khả năng sinh hoạt chất kháng Fusarium thì dịch kháng nấm khuếch tán xung quanh lỗ thạch tạo nên vòng kháng nấm, làm cho nấm không phát triển xung quanh lỗ thạch.
Đánh giá kết quả:
Đánh giá khả năng kháng nấm dựa vào khoảng cách vô khuẩn D - d (mm). D - d ≥ 25 mm: Hoạt tính kháng nấm rất mạnh.
D - d ≥ 20 mm: Hoạt tính kháng nấm mạnh. D - d ≥ 15 mm: Hoạt tính kháng nấm trung bình. D - d <10 mm: Hoạt tính kháng nấm yếu.
Trong đó: D là đường kính vô khuẩn, d đường kính lỗ thạch.
2.2.5. Tuyển chọn các chủng XK sinh chất kháng nấm
- Nhân giống:giống gốc từ MT bảo quản được hoạt hóa trên môi trường thạch nghiêng sau 7 ngày, thu huyền phù BT chuyển sang các bình tam giác dung tích 250ml chứa 50 ml môi trường Gauze - 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Lên men: chuẩn bị bình tam giác dung tích 250 ml chứa 50 ml môi trường Guaze – 1 dịch thể. Tiến hành bổ sung 2% MT nhân giống (v/V) (mật độ 108 BT/ml) vào bình môi trường đã chuẩn bị. Quá trình lên men kéo dài 72 giờ ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau đó thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lọc, bằng phương pháp khoan lỗ thạch.
Dựa vào kết quả D – d để chọn chủng XK sinh chất kháng nấm mạnh nhất.
2.2.6. Phương pháp định loại xạ khuẩn bằng kĩ thuật di truyền phân tử (Steyn, A.J.C. and Pretorius, 1992) (Steyn, A.J.C. and Pretorius, 1992)
Tách chiết bộ gen xạ khuẩn theo quy trình của Qiagen
Nguyên tắc
Thành tế bào của XK được phá vỡ giúp ADN được giải phóng ra. Protein và ARN được tách ra khỏi ADN nhờ các loại ARN-aza,, proteaza và các loại dung môi thích hợp.
Cách tiến hành
vận tốc 220 vòng/phút. Sau 72 giờ, lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf. Li tâm 8000 vòng/phút, trong 5 phút thu sinh khối xạ khuẩn. Huyền phù sinh khối với 54% TE và 25 µl lysozyme nồng độ 5 mg/ml được ủ ở 370C, trong 30phút.
Cho 30 μl SDS 10% và 3 μl protein K 20 mg/ml, đảo đều. Ủ ở 370
C, trong 1 h Tiếp tục cho 800 μl chloroform vào hỗn hợp trên, lắc mạnh. Sau đó, tiến hành ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút để thu dịch nổi.
Cho phenol (bằng thể tích dịch nổi thu được), vortex, ly tâm, thu dịch nổi Cho phenol : chloroform (bằng thể tích dịch thu được), vortex, ly tâm, thu dịch nổi (thực hiện 2 lần)
Cho chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, vortex, ly tâm thu dịch trong (thực hiện 2 lần)
Cho 10 μl RNase (20 μg/ul), ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Cho 0,7 lần thể tích Isopropanol
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa Rửa tủa bằng 500 μl ethanol 70%. Bảo quản -20 o
C.
Khuếch đại trình tự ARNr 16S
Sử dụng cặp mồi có trình tự như sau để khuếch đại vùng ARNr 16S của xạ khuẩn:
Mồi xuôi: 27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
Mồi ngược: 1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT’-3’
Thành phần của phản ứng PCR thu gen được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR Nước 77,5 µl dNTP 10 µl Buffer 10 µl 27F (100 pmol) 0,25 µl 1492R (100 pmol) 0,25 µl Template (500 ng/µl) 1 ul Enzyme (10U/µl) 1 µl Tổng thể tích 100 µl
Chu trình nhiệt
Tinh chế sản phẩm PCR
Sản phẩm khuếch đại được tinh chế bằng bộ kít QIAquick PCR Purification
Quy trình thực hiện:
Hỗn hợp sản phẩm được cho vào một eppendorf 1,5 ml
Bổ sung buffer PB với tỉ lệ 5:1 (v/v) so với thể tích sản phẩm PCR, trộn đều Chuyển dung dịch vào cột tinh chế. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 – 60 giây, đổ bỏ dịch sau khi qua cột
Bổ sung 750 µl buffer PE vào cột để rửa. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 – 60 giây, đổ bỏ phần dịch sau khi qua cột
Ly tâm lại 9000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn buffer PE Chuyển cột sang một eppendorf 1,5 ml mới
Bổ sung 30 – 50 µl Buffer EB (10mM Tris-HCl, pH 8,5) hay Mili Q vào chính giữa cột, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút, thu phần dịch chứa gen và ở nhiệt độ - 20oC.
Giải trình tự ARNr 16S
Sản phẩm khuếch đại sau khi tinh chế được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc).
Định danh chủng xạ khuẩn dựa vào trình tự ARNr 16S
Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit. Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST. Từ đó xác định tên loài của chủng nghiên cứu.
95°C 95°C 55°C 72°C 72°C 4°C 5 phút 30 giây 30 giây A phút 5 phút ∞ 1 2 x 30 chu kỳ 3
2.2.7. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp 2.2.7.1. Lựa chọn MT lên men thích hợp 2.2.7.1. Lựa chọn MT lên men thích hợp
- Nhân giống: giống gốc từ MT bảo quản được hoạt hóa trên MT thạch nghiêng sau 7 ngày, thu huyền phù BT chuyển sang các bình tam giác dung tích 250ml chứa 50 ml môi trường Gauze - 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong 48 h ở nhiệt độ phòng.
- Lên men: chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml lần lượt 4 môi trường dịch thể ISP-1, ISP-4 và Gauze -1, Gauze -2. Bổ sung 2% thể tích MT nhân giống (v/V) vào các bình tam giác đã chuẩn bị với tỉ lệ 2% thể tích với (mật độ 108 BT/ml). Tiến hành nuôi lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định hoạt tính kháng nấm của XK trong dịch lên men ở thời gian 24, 48, 72, 96, 120, 144 h bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Lựa chọn MT và thời gian nuôi cấy cho hoạt tính kháng nấm của XK đạt mức cao nhất.
2.2.7.2. Khảo sát nguồn cacbon thích hợp
Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT đã chọn. Bổ sung thay thế nguồn cacbon bằng tinh bột tan, glucozơ, lactozơ, saccarozơ vào MT nuôi cấy với một lượng tương đương.
Giống sau khi được hoạt hóa và nhân giống, tiến hành bổ sung một lượng MT nhân giống 2% (v/V) (108 BT/ml) và tiến hành lên men trên máy lắc, với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định ở trên), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nguồn cacbon thích hợp nhất.
2.2.7.3. Khảo sát hàm lượng cacbon thích hợp
Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường đã chọn. Bổ sung thay thế các hàm lượng khác nhau của nguồn cacbon đã xác định ở trên ở các mức: 16, 18, 20, 22, 24g.
Giống sau khi được nhân lên, tiến hành bổ sung một lượng MT nhân giống 2% (v/V) (108 BT/ml) và tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm
trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nồng độ cacbon thích hợp nhất.
2.2.7.4. Khảo sát nguồn nitơ thích hợp
Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường đã chọn (có bổ sung nguồn cacbon với nồng độ thích hợp đã chọn). Bổ sung thay thế lần lượt nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 và KNO3 vào 50 ml dung dịch môi trường nuôi cấy.
Sau đó, cấy vào MT lên men 1 lượng 2% (v/V) giống đã được nhân giống. Tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nguồn nitơ thích hợp nhất.
2.2.7.5. Khảo sát hàm lượng nitơ thích hợp
Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml dung dịch môi trường (dịch thể) đã chọn, có bổ sung nguồn cacbon với nồng độ thích hợp.
Bổ sung thay thế các hàm lượng khác nhau 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07g của nguồn nitơ đã xác định ở trên.
Sau đó, cấy 2% (v/V) giống đã được nhân lên và tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nồng độ nitơ thích hợp nhất.
2.2.7.6. Khảo sát pH thích hợp cho xạ khuẩn sinh hoạt tính kháng nấm
Cấy 2% (v/V) dịch nhân giống XK vào bình tam giác 250ml chứa 50 ml MT lên men, chỉnh pH ban đầu theo các mức khác nhau 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Sau đó tiến hành lên men trong điều kiện lắc (220 vòng/ phút), ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định) thử hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khoan lỗ thạch.
Lựa chọn pH ban đầu thích hợp để XK sinh hoạt tính kháng nấm cao nhất.
2.2.7.7. Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho xạ khuẩn sinh chất kháng nấm
Cấy 2% (v/V) XK đã được nhân giống vào 50 ml dung dịch MT (dịch thể) đã chọn trong bình tam giác 250ml, tiến hành nuôi lắc (220 vòng/ phút) ở các nhiệt độ
25, 28, 30, 35, 370C. Tiến hành lên men sau thời gian (đã khảo sát được) và thử hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp để XK sinh hoạt tính kháng nấm cao nhất.
2.2.7.8. Động học quá trình lên men tổng hợp chất kháng Fusarium từ XK
Mục đích của việc nghiên cứu động học lên men là để xác định thời gian và điều kiện tối ưu cho việc hình thành chất kháng nấm của chủng XK nghiên cứu.
Tiến hành lên men chủng đã được tuyển chọn cùng các đều kiện nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ với hàm lượng đã xác định và thời gian thích hợp. Tiến hành xác định sinh khối, hoạt tính kháng nấm và pH tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 132, 144 h. Vẽ đồ thị động học của quá trình sinh tổng hợp chất kháng Fusarium của chủng XK nghiên cứu. Xác định thời điểm tốt cho hoạt tính kháng nấm và thu sinh khối của chủng XK.
2.2.8. Phương pháp tách chiết chất kháng nấm
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong các dung môi hữu cơ của chất kháng nấm, tiến hành li tâm không những loại bỏ được sinh khối mà còn loại bỏ được các chất độc hại ra khỏi dịch nuôi cấy.
Cách tiến hành:
Sau khi nuôi cấy XK trong các điều kiện MT cụ thể đã xác định, trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau đó, tiến hành li tâm 5000 vòng/ phút để tách riêng dịch nuôi cấy và sinh khối.
Phần sinh khối:
Phần sinh khối được chiết bằng các loại dung môi khác nhau ( etanol, axeton, etyl axetat, metanol), với tỉ lệ là 1: 1. Hỗn hợp dung môi sinh khối này được lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó li tâm 5000 vòng/ phút để loại sinh khối. Cuối cùng dùng dung môi chiết được thử hoạt tính kháng nấm Fusarium
bằng phương pháp khoan lỗ thạch.
So sánh kết quả đo vòng kháng khuẩn để lựa chọn dung môi thích hợp để tách chất kháng nấm từ sinh khối XK.
Dịch nuôi cấy
Dịch nuôi cấy sau khi loại sinh khối có thể được tách chiết bằng các loại dung môi hữu cơ khác nhau như: n – butanol, etyl axetat, n – propanol và iso – butanoltỷ lệ giữa dịch chiết và dung môi là 1 : 1. Hỗn hợp dịch nuôi cấy và dung môi được lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thử hoạt tính kháng nấm
Fusariumtrong dung môi và trong dịch chiết bằng phương pháp khoan lỗ thạch. So sánh kết quả đo vòng kháng khuẩn để lựa chọn dung môi thích hợp để tách chất kháng nấm từ dịch nuôi cấy XK.
2.2.9. Xác định ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm của hạt và sự sinh trưởng của cây cà chua hạt và sự sinh trưởng của cây cà chua
Dịch lên men XK đã kiểm tra hoạt tính kháng nấm được pha loãng đến các nồng độ: 1, 10, 20, 50 và 100%. Ngâm hạt cà chua vào dịch pha loãng ở các tỉ lệ trên, sau 24 h vớt ra, đặt vào hộp Petri có lót bông thấm nước. Mỗi hộp đặt 150 hạt.