chuột nhắt trắng dòng BALB/c
Chuột nhắt trắng dòng BALB/c là chuột chuyên dùng để thử nghiệm khả năng miễn dịch. Vì vậy, chúng tôi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng dòng BALB/c để tạo kháng thể kháng protein N.
Một trong những yếu tố quan trọng giúp tăng khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên đối với động vật là chất bổ trợ kháng nguyên hay còn gọi là tá chất. Tá chất có tác dụng làm tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên, gây phản ứng viêm không đặc hiệu do đó làm tăng đáp ứng miễn dịch, ngoài ra tá chất còn làm cho kháng nguyên tồn tại lâu trong cơ thể vật chủ, kháng nguyên sẽ được thải ra từ từ vì vậy sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch nhiều lần làm tăng tính sinh kháng thể.
Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng (thời gian này dài hay ngắn phụ thuộc nhiều vào kháng nguyên, vào lần kháng nguyên xâm nhập lần đầu hay lần 2, lần 3,...). Sau đó, kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần đạt mức cao nhất sau 2 - 3 tuần, rồi lượng kháng thể giảm dần và biến mất sau vài tháng hoặc vài năm. Liều lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể nhiều, lượng kháng thể sinh ra nhiều. Nhưng lượng kháng nguyên chỉ có một giới hạn nhất định vì nếu lượng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 kháng nguyên nhiều quá sẽ gây độc cho cơ thể hoặc gây tê liệt miễn dịch, có thể gây hiện tượng dung nạp miễn dịch, kháng thể không được sản xuất ra. Vì vậy, chúng tôi gây miễn dịch theo phương pháp của Milstein và Kohler đưa ra năm 1975, có cải tiến (J. Eryl Liddell and A. Cryer - 2000). Theo phương pháp này chuột thuần chủng BALB/c (4 tuần tuổi) có trọng lượng trung bình 20 ± 5g được chia làm 3 lô thí nghiệm, lô 1 được tiêm kháng nguyên ở liều 10 µg /con/lần, lô 2 được tiêm kháng nguyên với liều 25µg /con/lần, lô 3 được tiêm kháng nguyên với liều 50µg /con/lần. Gây miễn dịch bằng đường tiêm dưới da: Trộn cộng hợp kháng nguyên với tá chất Freund toàn phần (Complete Freund Adjuvant) với tỷ lệ 1:1 rồi tiêm dưới da. Tiêm 4 lần vào các ngày: 1, 5, 10 và ngày 20. Chuột được lấy máu và thửđáp ứng miễn dịch vào ngày 30.
Hình 3.5: Chuột chuột nhắt trắng dòng BALB/c sau khi gây miễn dịch
Phản ứng ELISA có độ nhạy cao nên thường được sử dụng để kiểm tra sự đáp ứng miễn dịch của chuột đã gây miễn dịch. Sau quá trình gây miễn dịch, thu máu ởđuôi chuột và tách huyết thanh để kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm bằng kỹ thuật ELISA. Với kỹ thuật này, chuột có đáp ứng miễn dịch tốt tương đương với hàm lượng kháng thể cao sẽ cho giá trị OD trong phản ứng ELISA cao nhất. Huyết thanh chuột thu được pha loãng ở các nồng độ 10 lần, 50 lần, 250 lần và 500 lần trong dung dịch đệm carbonate, mỗi giếng phủ 100 µl
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 rồi ủ qua đêm ở 4oC. Kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/400 trong PBS ở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ, tiếp tục ủ với kháng thể kháng chuột cộng hợp HRP ở nhiệt độ phòng trong 45 phút và hiện màu với cơ chất TMB cho ELISA trong 15 phút. Dừng phản ứng và đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 450nm. Kết quả đo OD được thể hiện qua bảng 3.2:
Bảng 3.2: Giá trị OD của mẫu huyết thanh chuột ở các nồng độ pha loãng khác nhau
Độ pha loãng 10 lần 50 lần 250 lần 500 lần Đối châm ứng
Liều 50 µg/con/lần 3.564 2.889 0.986 0.287 0.045 Liều 25 µg/con/lần 3.687 2.791 0.899 0.267 0.041 Liều 10 µg/con/lần 3.598 2.789 0.698 0.172 0.043
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
Hình 3.6: Kiểm tra hiệu giá kháng thểở các nồng độ pha loãng khác nhau
Kết quảđược thể hiện qua đồ thị:
Hình 3.7: Hoạt độ kháng thể kháng protein N thu từ chuột được gây miễn dịch
Kết quảđo OD ở bảng 3.2 và hình 3.7 cho thấy mẫu huyết thanh chuột được gây miễn dịch bằng protein N được pha loãng ở các nồng độ khác nhau: thấp nhất là 10 lần và cao nhất là 500 lần với 3 mức liều kháng nguyên protein N là 10µg/ con/ lần, 25µg/con/lần, 50µg/con/lần đều cho kết quả dương tính (các giếng có giá trị OD cao gấp 3 lần so với đối chứng âm được cho là dương tính). Điều đó chứng tỏ trong mẫu huyết thanh chuột được pha loãng có chứa kháng thể kháng protein N. Ở các lô gây miễn dịch với liều kháng nguyên 10µg/ con/ lần, 25µg/con/lần và 50µg/con/lần, giá trị OD đo được không có sự chênh lệch nhiều, do đó có thể nói ở mức liều gây miễn dịch thấp nhất là 10µg kháng nguyên protein N/ con/ lần đã tạo được đáp ứng miễn dịch tốt trên chuột thí nghiệm.
Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch ở chuột còn được kiểm tra bằng phương pháp Western blot. Trong thí nghiệm này, 3 loại protein là protein N, protein MBP-N, BSA được điện di SDS- PAGE, sau đó chuyển sang màng PVDF để làm phản ứng Western blot với các mẫu huyết thanh thu được từ các lô chuột được gây miễn dịch. Kết quả thể hiện như sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
Hình 3.8. Hình ảnh điện di protein trước khi làm Western blot
1: Protein N sau khi cắt với thrombin và tinh sạch qua cột Ni-NTA; 2: MBP- protein N; 3: BSA; M: Marker protein)
Kết quả hình 3.8 cho thấy, tại đường chạy số 1 xuất hiện một băng điện di có kích thước tương đương 15kDa là mẫu protein N sau khi được cắt với enzyme
Thrombin và tinh sạch qua cột Ni- NTA. Tại đường chạy số 2 xuất hiện một băng có kích thước tương đương 57kDa là mẫu protein MBP- protein N. Đường chạy số 3 là mẫu BSA cũng xuất hiện một băng có kích thước lớn hơn kích thước của MBP- protein N. Các protein trên bản gel với trình tự tương tự bản gel này sẽđược chuyển lên màng PVDF trong vòng 1h ở hiệu điện thế 100V. Sau khi chuyển băng điện di lên màng, mỗi màng sẽ được ủ với huyết thanh của từng con chuột được gây đáp ứng miễn dịch ở các nồng độ khác nhau ở nhiệt độ phòng. Sau đó ủ với kháng thể kháng chuột cộng hợp HRP. Hiện màu với cơ chất TMB và chụp ảnh bằng máy ảnh thông thường. Nếu kháng thểđặc hiệu protein N có mặt trong huyết thanh chuột thì phản ứng miễn dịch đặc hiệu giữa kháng thể này với kháng nguyên protein N sẽ xảy
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 ra và ta có thể quan sát được các vạch màu trên màng PVDF. Kết quả Westen blot được thể hiện qua hình 3.9
Hình 3.9. Kết quả western blot với mẫu huyết thanh chuột được gây miễn dịch bằng kháng nguyên N
(1: Protein N sau khi cắt với thrombin và tinh sạch qua cột Ni-NTA; 2: MBP-protein N; 3: BSA; M: Marker protein)
Kết quả trên hình 3.9 cho thấy ở màng PVDF ủ với huyết thanh con chuột được gây miễn dịch với liều 25µg và liều 50µg đều thấy sự xuất hiện của một băng trùng với vị trí của protein N ban đầu, riêng màng được ủ với huyết thanh của con chuột được gây miễn dịch với liều 10µg/con/lần không thấy xuất hiện băng ở vị trí này có thể là do nồng độ protein được sử dụng để gây miễn dịch đối với con chuột này thấp hơn hai con còn lại hoặc băng này bị mất trong quá trình cắt bản gel điện di. Đồng thời ở cả 3 màng PVDF ủ với huyết thanh của từng con chuột được gây miễn dịch với liều lượng 10µg/con/lần, 25µg/con/lần và 50µg/con/lần đều thấy xuất hiện băng ở vị trí của protein MBP-N, điều này chứng tỏ cả ba mẫu huyết thanh thu từ 3 con chuột được gây miễn dịch với các liều lượng khác nhau đều có đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên đích hay nói cách khác huyết thanh chuột có chứa kháng thể kháng lại protein kháng nguyên N. Kết quả trên hình cũng cho thấy độđậm của các vệt băng tại vị trí protein N
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 và protein MBP protein N ở 3 lô thí nghiệm là tương đương nhau. Do đó có thể nói ở mức liều gây miễn dịch 10µg kháng nguyên protein N/con/lần gây được đáp ứng miễn dịch tốt trên chuột thí nghiệm.
Như vậy, kháng nguyên protein N có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tốt trên chuột thuần chủng dòng BALB/c và được kiểm chứng bằng phương pháp ELISA và Western blot. Điều này chứng tỏ kháng nguyên protein N tạo ra có hoạt tính tương tự như với kháng nguyên protein N trong virus PRRS và có thể dùng để tìm kháng thể kháng protein N, ứng dụng trong việc chẩn đoán bệnh do virus PRRS gây ra
3.2. Kết quả thử nghiệm tạo que thử chẩn đoán bệnh PRRS
Theo như phương pháp chế tạo que thử ở trên chúng tôi đã thử nghiệm tạo que thử chẩn đoán bệnh PRRS như hình 3.10
Hình 3.10. Que thử chẩn đoán bệnh PRRS
(1: Màng hút mẫu; 2: Màng chứa kháng thể kháng IgG lợn cộng hợp vàng; 3: Màng gắn kháng thể (có vị trí gắn kháng nguyên protein N và đối chứng là kháng thể
kháng lợn); 4: Màng hấp thụ
Hình 3.10 cho thấy, tại vị trí số 1 là màng hút mẫu, màng này có vai trò là nơi tiếp nhận mẫu dạng lỏng khi thử nghiệm, mẫu huyết thanh lợn sẽ được nhỏ lên vị trí màng này sau đó sẽđược dẫn truyền đến thành phần khác của que thử.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 Tại vị trí số 2 là màng chứa kháng thể cộng hợp là vùng chứa kháng thể kháng IgG của lợn cộng hợp vàng thường bảo quản ở dạng khô và kháng thể từ màng được giải phóng ở dạng tự do khi có dòng dung dịch mẫu từ màng thấm mẫu chảy qua. Kháng thể cộng hợp này kết hợp với kháng thể kháng protein N và phức hợp này sẽ cùng chạy trên màng.
Tại vị trí số 3 là màng gắn kháng thể (màng nitrocellulose) là màng có khả năng liên kết với protein bằng các liên kết hóa học. Trên màng có 1 vị trí gắnkháng nguyên protein N và 1 vị trí gắn kháng thể kháng IgG của lợn tương ứng với hai vị trí đểđọc kết quả trên màng của que thử. Nếu mẫu huyết thanh lợn có chứa kháng thể kháng protein N thì phản ứng sẽ xảy ra tại 2 vị trí gắn protein N và vị trí gắn kháng thể kháng IgG của lợn làm xuất hiện màu tại 2 vị trí đó. Nếu huyết thanh không chứa kháng thể kháng protein N thì phản ứng sẽ xảy ra tại vị trí có gắn kháng thể kháng IgG của lơn. Kháng nguyên protein N và kháng thể kháng IgG của lợn được đưa lên màng bằng máy phun, khí nén cho đầu phun được sử dụng là Nitơ lỏng đảm bảo hàm lượng kháng nguyên, kháng thể trên que thử được đồng đều. Sử dụng phương pháp phun lên màng rất có hiệu quả vì tiết kiệm được kháng nguyên, kháng thể.
Tại vị trí số 4 là màng hấp thụ, màng này có bản chất là các sợi cellulose ép lại với nhau thành tấm đóng vai trò quan trọng trong việc mao dẫn của que thử, định hướng mao dẫn dòng chảy của dung dịch trên que thử trong quá trình thử. Màng này sẽ tạo cho mao dẫn trên que thử chỉ chạy theo một chiều từ dưới lên mà không cho dòng mẫu chạy ngược trở lại, việc dòng mẫu chạy ngược lại sẽ làm tăng nguy cơ dương tính giả của que thử. Màng hấp thụ mạnh hay yếu cũng phần nào ảnh hưởng tới khả năng bắt giữ của kháng thể tại vị trí gắn protein N và kháng thể kháng IgG của lợn. Khi dòng dung dịch mẫu huyết thanh lợn chạy qua 2 vị trí này, chúng cần có một khoảng thời gian để bắt giữ mẫu, nếu chạy nhanh quá sẽ làm cho tỷ lệ phản ứng giảm, một phần nào chất bị chảy trôi không kịp phản ứng do đó sẽ làm giới hạn phát hiện kém đi hoặc sẽ tạo ra dương tính giả. Trong trường hợp màng hấp thụ yếu, tốc độ dòng dung dịch thấp sẽ kéo dài thời gian phản ứng, trong một số trường hợp như vậy sẽ không cho kết quả.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48
3.3. Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn bằng que thử
Sau khi tạo được que thử theo nguyên lý và thiết kế nhưđã giải thích ở trên, chúng tôi thử nghiệm kiểm tra 20 mẫu huyết thanh lợn. Các mẫu này đã được xét nghiệm bằng phương pháp ELISA trước đó (HerdCheck 2XR của Mỹ)
Khi nhỏ mẫu huyết thanh lợn vào vị trí nhỏ mẫu. Nếu lợn mắc bệnh PRRS, trong huyết thanh lợn sẽ chứa kháng thể kháng protein N của virus PRRS, phản ứng kháng nguyên – kháng thể diễn ra sẽ làm xuất hiện màu tại vị trí đường thử và đường đối chứng. Phản ứng được coi là dương tính khi xuất hiện đồng thời 2 vạch ở vị trí đường thử và vị trí đường đối chứng. Nếu lợn không mắc bệnh, trong huyết thanh lợn không có chứa kháng thể kháng protein N của virus PRRS, phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể không diễn ra, do đó không làm xuất hiện vạch màu tại vị trí đường thử, nhưng vẫn xuất hiện màu tại vị trí đường đối chứng do phản ứng giữa kháng thể kháng IgG lợn cộng hợp vàng với kháng thể lợn, phản ứng được coi là âm tính khi chỉ xuất hiện vạch màu tại vị trí đường đối chứng.
Kết quả kiểm tra bằng que thửđược thể hện qua hình 3.11
Hình 3.11(a). Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 (a)
Hình 3.11 (b). Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn
(A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng)
Hình 3.11 (c ). Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn
(A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng)
Kết quả hình 3.11 (a), (b),(c) cho thấy, các mẫu huyết thanh T7-5; T7-3; T7- 4; Q11; 61; T0-13; T0-12; T0-14, Q5; Q12; T7-1; T7-2 được kiểm tra bằng que thử
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 đều thấy xuất hiện đồng thời 2 vạch màu hồng tím tại vị trí A (vị trí đường thử) và vị trí B (vị trí đường đối chứng), điều đó đồng nghĩa với kết quả là dương tính. Que thử kiểm tra mẫu huyết thanh CTH3 và B26 có xuất hiện vạch màu tại vị trí B mà không có xuất hiện màu tại vị trí A, điều đó chứng tỏ kết quả là âm tính. Kết quả này cũng trùng hợp với kết quảđã được kiểm tra bằng ELISA.
Hình 3.11(d). Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn
(A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng)
Hình 3.11 (e). Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn
(A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng)
Hình 3.11 (d) cho thấy, que thử kiểm tra mẫu huyết thanh số 15 và 21có xuất hiện 2 vạch màu tại vị trí A và vị trí B, kết quả này được coi là dương tính. Kết quả
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 này trái ngược với kết quả đã được kiểm tra bằng ELISA (kết quả ELISA, mẫu huyết thanh số 15 và 21 là âm tính). Đây có thểđược coi là trường hợp dương tính giả do mẫu có bị lẫn với mẫu bệnh hoặc cũng có thể do phản ứng không đặc hiệu giữa kháng thể với thành phần trên que thử. Que thử kiểm tra mẫu số 30 không thấy xuất hiện vạch tại đường đối chứng và đường thử, điều này có thể do kháng thể