Vấn đề bất lợi hay gặp phải khi biểu hiện protein tái tổ hợp ởE. coliđó là sự hình thành protein tái tổ hợp không có hoạt tính do trong E. coli việc hình thành liên kết disulfide không hiệu quả, khả năng cuộn của protein trong tế bào chất không tốt và quá trình biến đổi sau dịch mã rất thấp. Chính vì vậy việc kiểm tra hoạt tính của protein tái tổ hợp đã được biểu hiện và tinh sạch là bước quan trọng để phục vụ cho các thí nghiệm sau.
Trong nghiên cứu này, kháng nguyên protein N sau khi tinh sạch được kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp ELISA và Dot blot với kháng thể chuẩn SDOW17A – Rural technology (Mỹ). Kháng thể này là kháng thể đặc hiệu với protein N của virus PRRS do đó chỉ có giếng nào có mặt protein N thì mới xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể
Phản ứng ELISA được bố trí với các giếng ELISA được phủ với các loại protein khác nhau: MBP protein, MBP protein N và PBS. Sau khi block các giếng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 với sữa, kháng thể chuẩn pha loãng 500 lần ở nhiệt độ phòng được đưa vào giếng. Bước tiếp theo các giếng được ủ với kháng thể kháng chuột cộng hợp HRP. Sau khi hiện màu với cơ chất TMB, dừng phản ứng và đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 405nm và 630nm. Kết quả thể hiện qua bảng 3.1 và hình 3.3:
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein N bằng phương pháp ELISA
Mẫu PBS MBP MBP-protein N
Giá trị OD 405nm 0.044 0.061 0.233 Giá trị OD 630nm 0.034 0.035 0.039 Giá trị OD405-630nm 0,01 0,026 0,194
Hình 3.3: Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein N bằng phương pháp ELISA
(Blank: Giếng phủ PBS; MBP: Giếng phủ protein fusionMBP; MBP-protein N: Giếng phủ MBP gắn với protein N)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 Kết quả đo OD bảng 3.1 cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa giếng chỉ có protein fusion MBP với giếng có MBP gắn với protein N. Giá trị OD đo được ở giếng có gắn MBP- protein N cao hơn nhiều so với giếng chứa PBS và giếng MBP. Hình 3.3 thể hiện rõ hơn sự khác biệt này, tại cột thứ nhất là Blank tương ứng với giếng chỉ phủ PBS tín hiệu OD đo được rất thấp, giá trị OD tương ứng tại giếng này là 0,01. Tại cột thứ hai là protein fusion MPB (Maltose Binding Protein) giá trị OD đo được là 0,026 thấp hơn rất nhiều so với cột thứ ba là MBP – protein N (0,194). Điều đó chứng tỏ, protein N được tạo ra trong nghiên cứu này có khả năng liên kết với kháng thể kháng PRRS chuẩn. Hay có thể nói là kháng nguyên protein N còn giữ hoạt tính tự nhiên của nó.
Để kiểm tra hoạt tính của kháng nguyên protein N, phản ứng Dotblot cũng được thực hiện tương tự ELISA. Đối với phương pháp Dot blot điểm khác biệt là kháng nguyên được gắn trực tiếp lên màng PVDF thay cho gắn vào giếng nhựa ELISA và có thể nhìn thấy kết quả bằng mắt thường sau khi thực hiện phản ứng hiện màu với cơ chất riêng biệt. Bản chất của màng PVDF là có thể gắn được với các loại protein, kháng nguyên và kháng thể có bản chất là protein nên đều có thể gắn được lên màng PVDF. Do vậy sau khi đưa kháng nguyên lên màng, màng sẽ được phủ sữa (ủ với skim milk 5%) nhằm mục đích tránh tạo các liên kết không đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể vì sữa sẽ phủ lấp những vị trí màng không có gắn kháng nguyên. Phản ứng cho kết quả hình 3.4.
Hình3.4:Kết quả kiểm tra hoạt tính của kháng nguyên bằng phương pháp Dot blot
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
màngPVDF có chấm BSA, MBP fusion, MBP-protein N hàm lượng 3ug , MBP-protein N hàm lượng 6ug)
Kết quả hình 3.4 cho thấy, ở vị trí đặt mẫu BSA và MBP fusion là các protein đối chứng không thấy xuất hiện vệt màu do không có sự liên kết giữa protein N tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu SDOW17A – Rural technology (Mỹ). Còn tại vị trí đặt mẫu MBP- protein N với hàm lượng 3µg và 6 µg thì có xuất hiện một vệt màu. Vệt màu này xuất hiện do có sự liên kết giữa protein N có trong mẫu với kháng thể đặc hiệu, độ đậm của màu phụ thuộc vào hàm lượng protein đưa lên màng, tại vị trí MBP protein N hàm lượng protein được đưa lên màng là 6 µg, vệt màu xuất hiện đậm hơn so với tại vị trí MBP protein N hàm lượng protein đưa lên màng 3 µg. Điều này khẳng định lại một lần nữa là kháng nguyên protein N còn giữ nguyên hoạt tính của nó.