Chẩn đoán nhanh sự tồn tại của tác nhân gây bệnh dựa trên cơ sở phản ứng kháng nguyên – kháng thể là một trong những hướng ứng dụng đang được quan tâm trên thế giới cũng như Việt nam.
1.3.2.1. Bản chất của sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể. Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giới hạn giữa phân tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của phân tử kháng thể (trung tâm hoạt động).Theo Pauling, phân tử kháng thể thường hóa trị hai nghĩa là cùng một lúc có thể kết hợp với hai phân tử kháng nguyên. Còn kháng nguyên đa hóa trị nên cùng một lúc có thể kết hợp với nhiều phân tử kháng thể. Cho
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 nên kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau để tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong không gian ba chiều. Vì kích thước quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết.
Kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau theo bất cứ tỷ lệ nào nhưng phản ứng yếu đi nếu thừa hoặc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể. Phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với số phân tử kháng thể.
Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu. Một kháng nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành. Do đó phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tửđã biết.
Hiệu giá của kháng thể ở trong huyết thanh người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên. Ngược lại nhờ kháng thể đã biết những kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể nhận mặt. Mặt khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép chọn lựa thích đáng vi sinh vật dùng làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng
1.3.2.2.Phản ứng kết tủa
Nguyên lý
Phản ứng kết tủa là sự kết hợp giữa kháng nguyên hòa tan lúc gặp kháng thể tương ứng, tạo thành tủa có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc nhờ soi kính lúp. Kháng nguyên đa hóa trị kết hợp với kháng thể hóa trị hai để tạo thành kết tủa hình mạng lưới 3 chiều. Phản ứng có thể thực hiện ở môi trường lỏng hoặc môi trường gel.
1.3.2.3. Phản ứng ngưng kết
Nguyên lý
Phản ứng ngưng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên hữu hình với kháng thể tương ứng tạo thành các hạt ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường. Kháng nguyên có thể là vi khuẩn, hồng cầu, bạch cầu, tinh trùng…Phản ứng ngưng kết chỉ xảy ra nếu có chất điện giải, rõ nhất, nhanh nhất ở pH từ 7 đến 7,2 và ở nhiệt độ 37oC
1.3.2.4.Phản ứng kết hợp bổ thể
Nguyên lý
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 hoặc một số tế bào động vật khác.
1.3.2.5. Phản ứng trung hòa virus
Nguyên lý
Kháng thểđặc hiệu có khả năng trung hoà độc tố, độc lực của vi sinh vật,làm mất đi một tính chất nào đó của vi sinh vật hoặc sản phẩm của nó.
Nhiều loài virus phát triển ở tế bào thì phá hủy các tế bào (hiện tượng tế bào bệnh lý) nhưng nếu cho kháng thể tương ứng của virus vào đồng thời với virus thì virus bị trung hòa không nhân lên được và hiện tượng tế bào bệnh lý không xảy ra. Phản ứng này được sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cũng nhưđịnh type virus. Mặt khác cũng có thể định lượng kháng thể của virus ở trong huyết thanh bằng cách trộn hỗn hợp kháng huyết thanh với virus rồi tiêm hỗn hợp vào một nhóm động vật nhạy cảm. Nếu động vật thử nghiệm không cho thấy triệu chứng bệnh thì sự hiện diện của kháng thể trung hòa đã được chứng minh.
1.3.2.6. Phản ứng miễn dịch enzym (Enzyme-Linked- ImmunoSorbent Assay: ELISA)
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏđã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh
1.3.2.7. Phản ứng miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay: RIA)
Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như ThymidinH3, Cacbon 14,...đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể. Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể) đã đánh dấu đồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản tổ chức học,sau đó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường.
1.3.3. Phương pháp RT-PCR
Phương pháp RT-PCR cần được sử dụng trong việc kiểm soát tính sạch bệnh ở tinh dịch sử dụng trong thụ tinh nhân tạo và theo dõi các đàn lợn nhiễm khi cần tái lập tình trạng sạch bệnh. Phương pháp RT-PCR đơn giản, ít tốn kém và nhanh hơn rất nhiều so với thử nghiệm có tên là “swine bioassay” vốn được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong việc xác đinh PRRSV. Kỹ thuật RT-PCR nhạy hơn phân lập virus, có thể phát hiện 10 phần tử virus/ml tinh dịch và hoàn toàn đặc hiệu. Hai vùng gene bảo tồn cao là ORF 6 mã hóa protein màng và ORF 7 mã hóa protein nhân (nucleocapsid) thường được dùng để thiết kế primer (mồi) cho phản ứng RT-PCR phát hiện PRRSV. Một số vùng khác như ORF 5 mã hóa protein vỏ (envelope) được sử dụng khi cần phân biệt các chủng (chủng độc lực cao- chủng thường).