Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể.
Hình 2.1. Sơđồ phản ứng ELISA
Cách tiến hành
- Protein N sau khi tinh sạch được pha trong đệm PBS và phủ trên giếng ELISA ở nồng độ 3µg/giếng, ủ qua đêm ở 4 oC.
- Sau đó các giếng phủ mẫu được rửa với 200 µl đệm PBST (PBS+ 0,05% Tween 20) 6 lần.
- Phủ các giếng bằng 5% skim milk trong 3h ở nhiệt độ phòng. - Lặp lại bước rửa với PBST.
- Tiếp tục ủ các giếng với 100 µl kháng thểđặc hiệu protein N SDOW17A – Rural technology (Mỹ) được pha loãng 500 lần ở nhiệt độ phòng trong 2h.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 - Tiếp tục ủ các giếng với 100 µl kháng thể kháng chuột cộng hợp HRP trong 2h ở nhiệt độ phòng.
- Lặp lại bước rửa với PBST.
- Hiện màu với cơ chất TMB cho ELISA trong vòng 15 phút.
- Dừng phản ứng bằng cách thêm vào mỗi giếng 100 µl H2SO4 1N và đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 405nm và 630nm. Đối chứng là giếng chỉ phủ PBS và protein MBP fusion.