Tinh sạch protein là một bước quan trọng để thu nhận protein mục tiêu. Có rất nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau như sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc kí ái lực…Tùy vào đặc tính protein khác nhau có thể lựa chọn phương pháp tinh sạch khác nhau. Trong thí nghiệm của chúng tôi, phương pháp sắc ký ái lực được xem là phương pháp hiệu quả nhất. Vì phương pháp này dựa vào ái lực liên kết để thu nhận protein, do đó hiệu quả tinh sạch cao hơn.
Protein N tái tổ hợp được tạo ra là protein được biểu hiện trong vector MBP fusion, trình tự dịch mã của vector này có kèm theo một đoạn 6xHistidine gọi tắt đuôi His-tag dùng cho việc tinh sạch protein tái tổ hợp, đuôi His-tag được mã hóa bởi các bộ 3 mã hóa nằm trên vector do nhà sản xuất thiết kế có ái lực mạnh với Ni2+. Cột Ni-NTA của invitrogen có thể dùng để tinh sạch những protein tái tổ hợp được biểu hiện trong nhiều loại vật chủ khác nhau như : vi khuẩn, côn trùng, tế bào động vật. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hệ thống tinh sạch Ni-NTA của invitrogen. Ni2+ gắn với hỗn hợp NTA (Nitrilotriacetic) là giá thể để tinh sạch protein tái tổ hợp có đuôi his - tag. Theo hướng dẫn của hãng Invitrogen việc tinh sạch protein tiến hành theo 3 phương pháp: native, denaturing và hybrid. Tinh sạch trong điều kiện native áp dụng đối với các protein hòa tan do vậy protein giữ được nguyên hoạt tính. Sự gắn kết ái lực giữa đuôi his-tag với Ni2+ sẽ giữ lại protein tái tổ hợp, những protein khác sẽ bị rửa trôi bằng Imidazol ở nồng độ thấp. Sau đó protein tái tổ hợp được giải hấp bằng Imidazole ở nồng độ cao và thu lại để kiểm tra. Các bước được tiến hành như sau: Tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pSV278/ORF7 được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi lắc ở 37oC đến khi mật độđạt 0.6 tiến hành cảm ứng bằng IPTG với nồng độ cuối cùng là 0,1mM, sau 3 giờ cảm ứng tiến hành thu mẫu. Dịch tế bào được ly tâm 6.000 v/ph trong 20 phút để thu sinh khối. Cặn tế bào sẽ được hòa tan trong 8ml đệm phá tế bào, siêu âm phá tế bào và tiến hành tinh sạch
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 theo điều kiện native của hãng Invitrogen. Để kiểm tra kết quả tinh sạch, các mẫu trước cảm ứng, sau cảm ứng và tinh sạch được điện di trên gel polyacrylamide. Kết quả kiểm tra được thể hiện qua hình 3.1:
Hình 3.1: Kết quả tinh sạch protein MBP fusion N tái tổ hợp
(M: Marker; giếng 1: Dịch tế bào trước cảm ứng; giếng 2: Dịch tế bào sau cảm
ứng; giếng 3, 4, 5, 6: ProteinMBP fusion với protein N sau khi tinh sạch)
Kết quả kiểm tra trên hình ảnh điện di (hình 3.1) cho thấy, dịch tế bào sau cảm ứng (tại đường chạy số 2) có xuất hiện một băng protein đậm có kích thước phân tử khoảng 57kDa khác biệt so với mẫu dịch tế bào trước cảm ứng (đường chạy số 1), kích thước băng này tương đương với kích thước của protein N tái tổ hợp gắn với fusion protein. Tại các đường chạy số 3, 4, 5, 6 là các phân đoạn protein sau khi tinh sạch bằng hệ thống Ni-NTA, sản phẩm điện di protein chỉ còn lại một băng duy nhất đúng với kích thước của protein MBP fusion N tái tổ hợp được tạo ra (57 kDa). Protein MBP fusion N tái tổ hợp tinh sạch được bao gồm protein N và protein MBP fusion, protein này có kích thước khoảng 57kDa trong đó kích thước protein N là 15kDa, kích thước protein fusion 42kDa, với hiệu suất tinh sạch trên 80%, protein MBP fusion N tái tổ hợp có độ tinh sạch tương đối cao nên có đủ tiêu chuẩn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Trong nghiên cứu này protein N tái tổ hợp của virus gây bệnh PRRS được biểu hiện trong vector biểu hiện MBP fusion. Việc sử dụng các fusion vector trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 biểu hiện protein tái tổ hợp có một số tác dụng như làm tăng sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, tăng tính hòa tan của protein tái tổ hợp, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tinh sạch. Để sử dụng cho việc gây đáp ứng miễn dịch trên chuột thí nghiệm, protein N tái tổ hợp sau khi tinh sạch sẽ được cắt bằng enzym Thrombin
ở 37oC. Do kích thước của protein N (15kDa) nhỏ hơn rất nhiều so với kích thước của protein N gắn với MBP fusion (57kDa). Nếu sử dụng protein N gắn với MBP fusion gây miễn dịch trực tiếp cho chuột thí nghiệm thì protein này có kích thước lớn mà bao gồm kích thước chủ yếu của protein fusion, protein này không có vai trò trong việc gây đáp ứng miễn dịch. Theo cơ chế sinh miễn dịch, tính đặc hiệu của mỗi đáp ứng miễn dịch có được là do mỗi kháng nguyên có một cấu trúc riêng. Tính đặc hiệu không phải do toàn bộ kháng nguyên quyết định, mà do một hoặc nhiều đoạn nhỏ nằm trên phân tử kháng nguyên quyết định, đó là các epitop. Epitop có hai chức năng, một là kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên đó và hai là làm vị trí để kháng thể hoặc tế bào lympho mẫn cảm có thể gắn vào một cách đặc hiệu. Một kháng nguyên phức tạp có thể có nhiều epitop khác nhau do đó mà có thể kích thích tạo ra nhiều loại kháng thể khác nhau cùng một lúc. Vì vậy, mục đích của việc cắt protein N ra khỏi protein N gắn với MBP fusion để tạo ra kháng nguyên protein N có kích thước đơn giản nhằm tạo được đáp ứng miễn dịch tốt nhất khi gây nhiễm protein N vào chuột thí nghiệm. Kết quả cắt protein N gắn với MBP được thể hiện qua hình 3.2.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Hình 3.2: Kết quả cắt protein MBP-protein N bằng enzyme Thrombin
(M: Marker;1: Sản phẩm protein sau khi cắt 0,5h, 2: Sản phẩm protein sau khi cắt 1h)
Protein MBP fusion N tái tổ hợp được ủ với enzyme Thrombin ở các khoảng thời gian khác nhau (0,5 giờ; 1 giờ). Kết quả trên hình 3.2 cho thấy tại đường chạy số 1, protein MBP fusion N được cắt bằng enzyme Thrombin ủ 37oC trong 0,5 giờ thì lượng protein chưa được cắt hoàn toàn, sản phẩm thu được là 3 băng: băng thứ nhất là băng tương ứng với protein MBP fusion N có kích thước phân tử 57kDa, băng thứ hai là băng tương ứng với protein fusion (MBP) có kích thước phân tử khoảng 42kDa và băng thứ ba là băng tương ứng với protein N có kích thước phân tử khoảng 15kDa. Tại đường chạy số 2, protein MBP fusion N được cắt bằng enzyme Thrombinủ 37oC trong 1h tạo thành 2 băng protein riêng biệt là protein N (kích thước khoảng 15kDa) và protein fusion (kích thước khoảng 42kDa). Như vậy protein sau khi tinh sạch được ủ với enzyme Thrombin ở 37oC trong 1h thì protein N được cắt hoàn toàn triệt để. Protein N sẽ được thu lại bằng cách cho hỗn hợp protein sau khi cắt qua cột Niken, protein fusion có gắn đuôi his-tag nên được giữ lại trên cột, phần dung dịch chảy qua cột sẽ là protein N. Sau đó protein này được đưa vềđệm phù hợp và cô đặc hơn phục vụ cho phản ứng gây đáp ứng miễn dịch.