IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.5.2.đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật chiết bằng các loạ
môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease
Thắ nghiệm ựược tiến hành nhằm mục tiêu xác ựịnh ựược dịch chiết thực vật chiết bằng dung môi hữu cơ có khả năng kìm hãm hoạt tắnh enzyme urease tốt nhất.
Các dung môi hữu cơ như methanol, actone, acetonitrile là những dung môi hữu cơ cơ bản thường ựược sử dụng trong chiết tách các hợp chất thứ cấp từ thực vật. Do ựó, trong thắ nghiệm này chúng tôi tiến hành thử nghiệm chiết tách dịch chiết các mẫu thực vật mục tiêu bằng các dung môi hữu cơ khác nhau
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 57 (methanol 70%, methanol 85%, actone 70%, acetonitrile 70%). Mẫu thực vật ựược nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn. 0,5g mẫu bột mịn ựược bổ sung vào ống falcon 50ml chứa 25 ml dung môi hữu cơ. Sau ựó, ống ựựng dung dịch mẫu ựược xử lý bằng sóng siêu âm trong ựiều kiện lạnh, ựể phá vỡ tế bào thực vật. Sau 10Ỗ, hỗn hợp dung dịch ựược ly tâm 4000 vòng/phút, 10Ỗ, thu dịch nổi phắa trên. Ống ựựng mẫu dịch chiết thực vật ựược mở lắp ựể qua ựêm trong ựiều kiện vô trùng ựể loại bỏ dung môi hữu cơ. Sau ựó, dịch chiết thực vật ựược tiến hành ựánh giá khả năng kìm hãm hoạt tắnh enzyme urease bằng phương pháp khuếch tán ựĩa thạch. 30ộl dịch chiết thực vật thô ựược trộn ựều với 3ộl enzyme urease trong 20ộl ựệm sodium phosphat buffer. Hỗn hợp ựược ủ ở 370C, 10Ỗ. đĩa petri chứa môi trường chỉ thị ChristensenỖs Urea Agar ựược ựục các lỗ giếng thạch có ựường kắnh 7mm. Sau 10Ỗ, hỗn hợp ựược nhỏ vào giếng thạch với lượng 40 ộl/CT/giếng. Dịch chiết thực vật sử dụng trong thắ nghiệm ở nồng ựộ không pha loãng, pha loãng 2 lần. Giếng ựối chứng chứa enzyme urease không bổ sung dịch chiết thực vật. Khả năng kìm hãm của dịch chiết thực vật lên hoạt tắnh enzyme urease thương mại ựược thể hiện qua ựường kắnh vòng phân giải và ựộ ựậm màu hồng quanh giếng thạch. đó là do trên môi trường chỉ thị, enzyme urease hoạt ựộng phân giải urê sinh NH3 làm pH môi trường chuyển từ trạng thái acid (môi trường có màu vàng) sang trạng thái bazơ (môi trường có màu hồng). Dịch chiết thực vật có khả năng kìm hãm hoạt tắnh enzyme urease thì màu hồng xuất hiện quanh giếng thạch nhạt hơn và kắch thước vòng màu hồng sẽ nhỏ hơn so với giếng ựối chứng không bổ sung dịch chiết thực vật. Kết quả thu ựược sau 30Ỗ nhỏ hỗn hợp mẫu thắ nghiệm vào các giếng ựược thể hiện ở hình 12.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 58
Hình 12ạ Ảnh hưởng của dịch chiết dàng mê công chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease thương mại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 59
Hình 12b. Ảnh hưởng của dịch chiết puồng ựìa nhau chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease thương mại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 60
Hình 12c. Ảnh hưởng của dịch chiết ựìa sài chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease thương mại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 61
Hình 12d. Ảnh hưởng của dịch chiết ựìa chụt chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease thương mại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 62
Hình 12ẹ Ảnh hưởng của dịch chiết tầm gửi ký chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease thương mại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 63
Hình 12f. Ảnh hưởng của dịch chiết tùng diè chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease thương mại
Hình 12g. Ảnh hưởng của dịch chiết xà ựìa pi chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau ựến hoạt tắnh enzyme urease thương mại
Ghi chú: 1: CT1: 20 ộl SB + 30 ộl dịch chiết thực vật (DCTV) gốc + 3 ộl Urease 2: CT2: 20 ộl SB + 30 ộl DCTV pha loãng 2 lần + 3 ộl Urease
3: CT3: 20 ộl SB + 30 ộl buffer + 3 ộl ộl nước deion 4: CT4: 20 ộl SB + 30 ộl DCTV gốc + 3 ộl nước deion 5: CT5: 20 ộl SB + 30 ộl nước deion + 3 ộl Urease
M-70: Methanol 70%, M-85: Methanol 85% A-70: Aceton 70%, T-70: Acetonitrile 70%
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 64 Kết quả thắ nghiệm cho thấy, ở các giếng số 3: chỉ chứa các dung môi hữu cơ khác nhau (methanol 70%, methanol 85%, aceton 70%, actonitrile 70%) và giếng số 4: chỉ chứa dịch chiết ựìa sài không làm ảnh hưởng ựến sự ựổi màu môi trường. Các mẫu thực vật ựược chiết bằng các dung môi hữu cơ cho dịch chiết màu xanh nhạt (màu của diệp lục). Khi thực hiện phản ứng trên ựĩa thạch, màu sắc dịch chiết không gây ảnh hưởng ựến kết quả phản ứng.
Nhìn chung, các giếng số 1, dịch chiết các mẫu thực vật không pha loãng có khả năng kìm hãm cao hoạt tắnh enzyme urease, ựược thể hiện qua màu hồng nhạt xuất hiện quanh giếng. Trong khi ựó, ở giếng số 2: dịch chiết các mẫu thực vật ựược pha loãng 2 lần, khả năng kìm hãm của dịch chiết ựối với hoạt tắnh enzyme urease kém hơn so với dịch chiết không pha loãng. Quan sát màu hồng xuất hiện ở các giếng thạch cho thấy, các mẫu thực vật ựược chiết bằng dung môi acetonitrile thể hiện khả năng kìm hãm hoạt tắnh enzyme urease tốt nhất so với khi ựược chiết bằng các dung môi: methanol 70%, methanol 85%, aceton 70%. Kết quả ựược thể hiện thông qua màu hồng xuất hiện ở các giếng số 1 (các mẫu thực vật chiết bằng acetonitrile), màu hồng xuất hiện quanh giếng rất nhạt và rất nhỏ.
Các mẫu thực vật ựược chiết bằng bốn loại dung môi khác nhau (methanol 70%, methanol 85%, aceton 70% và acetonitrile 70%) ựều có khả năng kìm hãm hoạt tắnh enzyme urease ở các công thức 1 (dịch chiết thực vật không pha loãng). Trong ựó, kết quả bước ựầu cho thấy, dịch chiết bằng acetonitrile 70% có khả năng kìm hãm hoạt tắnh enzyme urease tốt nhất.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 65