I. CƠ SỞ HÌNH THÀNH HỆ THỐNG GIÁM SÁT DỊCH BỆNH VÀ MÔI TRƯỜNG
5. PHƯƠNG PHÁP GIÁM SÁT VÀ CẢNH BÁO
5.2. Phương pháp phân tích đánhgiá và cảnh báo dịch bệnh
Phương pháp phân tích đánh giá
9 Phân tích định tính tảo độc theo tài liệu của các tác giả Nguyễn ngọc Lâm, Đoàn Như Hải và ctv, (2000); Nguyễn Tác An (1998); Đặng Đình Kim (1999); Hallegraeff G.M. (1995); Romeo D.Caturao (2001).
9 Phân tích định lượng tảo độc: sử dụng buồng đếm Sedgwick-Rafter, có thể tích 1 ml (50 mm x 20 mm x 1 mm), chia 1000 ô đều nhau. Hiện có 5 phương pháp phân tích và xác định tảo độc: Soi kính hiển vi; sử dụng các đại phân tử hay phương pháp hoá tế bào;
phản ứng kháng nguyên kháng thể; xét nghiệm bằng lai phân tử hoặc sử dụng một số chỉ thị phân tử.
Phân tích mẫu bệnh:
Theo OIE, cần thiết tiến hành kiểm tra ký sinh trùng (mức độ II); phân lập nấm (mức độ II); phân lập vi khuẩn (mức độ II); phân lập vi rút (mức độ III); thực hiện phuơng pháp PCR (mức độ III) và thực hiện các thí nghiệm mô học (mức độ II).
I, II, III là các mức độđược quy định trong phân tích các mẫu bệnh và chẩn đoán bệnh, cụ thể:
(I): Mức độ I: Sử dụng các phương pháp chẩn đoán lâm sàng (quan sát con vật và môi trường).
(II): Mức độ II: Sử dụng các phương pháp xét nghiệm chuyên sâu về ký sinh trùng, nấm, vi khuẩn và mô bệnh học.
(III): Mức độ III: Sử dụng các phương pháp chuẩn đoán tiên tiến (virus học, kính hiển vi điện tử, miễn dịch học, sinh học phân tử).
Dựa theo các mức độ trên, người quan trắc triển khai các thí nghiệm để có các phân tích và chẩn đoán bệnh kịp thời, hạn chế dịch bệnh và thiệt hại cho người nuôi.
9 Xác định sự có mặt cũng như phân loại vi sinh vật trên các mẫu thu bằng các phương pháp nuôi cấy, phân tích với các môi trường đặc trưng (Vibrio: môi trường TCBS, vi rút MBV, đốm trắng: kiểm tra PCR trên Test kit WSSV/MBV Multiplex PCR Mix); xác định tỷ lệ và cường độ cảm nhiễm.
9 Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng
Vd: Thu mẫu động vật thủy sản nuôi tại điểm quan trắc, tiến hành giải phẫu và nghiên cứu tại hiện trường theo phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng của Dogiel, 1960. Các chỉ số cần kiểm tra: tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm và phân loại ký sinh trùng.
9 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
Vd: Mẫu nước tại mỗi điểm được thu và bảo quản trong đá lạnh suốt thời gian tại thực địa.
Tại phòng thí nghiệm, định lượng vi khuẩn theo phương pháp Musselius V A, 1989 John A Plumb và Paul R Bonser, 1983. Mẫu nước được pha loãng với nước muối sinh lý theo các hệ số K khác nhau. Lẫy mẫu bằng micro pipet nhỏ trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau rồi trang đều. Mẫu được để trong tủấm sau 24h khuẩn lạc mọc, mỗi khuẩn lạc là 1 vi khuẩn.
N = A* K * 1/V
A: Số khuẩn lạc trung bình mọc lên khi nuôi cấy ở các đĩa từ 1 hệ số V: Số ml mẫu đã dùng để định lượng
K: Hệ số pha loãng
9 Phương pháp nghiên cứu nấm
Vd: Định lượng và xác định thành phần loài theo 3 nồng độ 29, 15 và 1 ml nước mẫu với 1, 15 và 29 ml nước APW, sau đó cho mỗi nồng độ 1 ml môi trường định lượng và thả mồi để nấm ký sinh và phát triển. Tiến hành xác định loài thông qua các đặc điểm về cấu trúc thân nấm và bào tử nấm.
9 Phương pháp mô bệnh học
Có nhiều phương pháp được sử dụng, ví dụ phương pháp của Lightner D V, 1996
Cốđịnh mẫu: Cốđịnh trong dung dịch Davidson với tỷ lệ dung dịch cốđịnh mẫu là 10:1. Ngâm mẫu cốđịnh từ 24-72 tuỳ theo kích thước mẫu, sau đó chuyển mẫu sang cồn 70%. Khử nước ở mẫu cốđịnh: Cho mẫu ngâm ở cồn 70% qua lần lượt 3 ống cồn có nồng độ: 80, 90, 100%, mỗi nồng độ ngâm 2 lần trong thời gian 30 – 60 phút.
Làm trong mẫu: Chuyển mẫu đã khử nước sang dung dịnh làm trong mẫu (Xylen) thời gian từ 30 – 60 phút và lặp lại hai lần.
Thấm parapin: Chuyển mẫu đã làm vào đĩa parapin, đun nóng ở nhiệt độ 50-58 oC trong 1h.
Đúc mẫu: Đặt mẫu vật đã thấm parapin vào khuôn đúc parapin, giữ mẫu tập trung về một mặt của khuôn để khi cắt mô dễ dàng hơn. Sau đó đổ parapin vào khuôn và làm lạnh ở bàn tủ lạnh. Cắt gọt các parapin thừa và cắt sâu vào mặt khối mẫu 3mm. Sau đó gắn khối parapin vào máy cắt mô.
Cắt mẫu: Dùng máy cắt mô, lát cắt dày 5 µm. Đặt lát cắt vào nước ấm sau đó dùng chổi lông lấy mẫu đặt lên lam kính.
Nhuộm mẫu: dùng thuốc nhuộm H – E (Hematoxyline và Eosin).
Đọc kết quả: Xem các tiêu bản đã nhuộm dưới kính hiển vi điện tử độ phóng đại 100- 1000 lần để nhận biết sự biến cấu trúc mô.
9 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Hiện nay, phương pháp PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm chẩn đoán… để phát hiện mầm bệnh, vi sinh vật, vi rút, tạo đột biến gen và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của các loài động thực vật. PCR được sử dụng chẩn đoán các bệnh tôm (MBV, WSSV, YHV, TSV..) và bệnh cá (VNN…).
Hình 4.5. Quy trình chẩn đoán tác nhân vi rút gêy bệnh trên tôm
Phương pháp cảnh báo dịch bệnh
9 Hình thành hệ thống mạng thông tin và báo cáo (cảnh báo dịch bệnh) Hàng tuần các địa phương định kỳ gửi báo cáo (dữ liệu) về trạm vùng Hàng tháng trạm vùng báo cáo cho trung tâm miền
Hàng quý trung tâm miền báo cáo về văn phòng trung ương Hàng quý văn phòng trung ương báo cáo cho OIE
9 Phương tiện cảnh báo
Bằng công văn đến các sở, trạm vùng như phiếu kết quả thu mẫu trong đó có các khuyến cáo dưới hình thức cảnh báo.
Báo cáo tổng hợp
Bằng các phương tiện thông tin đại chúng nhưđiện thoại, fax; email hoặc website.
9 Sơ đồ hoạt động của hệ thống quan trắc, cảnh báo dịch bệnh thuỷ sản
Hình 4.7. Sơđồ hoạt động của hệ thống quan trắc, cảnh báo dịch bệnh thuỷ sản
9 Muốn việc cảnh báo thực sự chính xác, có ý nghĩa và hiệu quả thì ngoài việc thực hiện tốt quan trắc còn cần một hệ thống báo cáo nhanh, chính xác và khoa học.