L ỜI CẢM ƠN
6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ
Từ các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác nhau trong RNM Cần Giờ, chúng tôi tiến hành phân lập theo phương pháp của Traves (1987), sử dụng tác nhân chọn lọc là natri acetate. Trước khi phân lập, các mẫu được gia nhiệt ở 800C trong 30 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh BT. Kết quả thu được 28 dạng khuẩn lạc (KL) khác nhau, tạm gọi là 28 chủng và được kí hiệu là P1, P2,…,P28.
Sau đó, tiến hành nuôi cấy các chủng trên môi trường T3 ở 300C. Sau 48 h, tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc, làm tiêu bản nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue trong 3 phút để quan sát hình dạng tế bào, tinh thể và bào tử. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được Ký hiệu chủng Hình thái KL Hình thái TB BT Tinh thể độc P1 KL nhỏ, màu trắng trong, bề mặt nhẵn, viền mờ, đường kính khoảng 2mm. Hình que, BT hình ovan, hơi lệch tâm.
+ - P2 KL có màu vàng nhạt, có nhầy nhớt, đường kính khoảng 3mm. Hình sợi dài, xếp chồng lên nhau. - - P3
KL có màu trắng kem, viền nhăn, có núm nhỏ ở tâm, nhìn nghiêng bề mặt hơi sần sùi, đường kính khoảng 5mm.
Hình que, hai đầu hơi tù, xếp riêng rẽ, BT hình trứng, chính tâm.
+ +
hiệu chủng thể độc P4 KL to, có màu trắng kem, hình tán xạ như bông hoa, có khả năng di động, đường kính khoảng 6mm. Hình que, xếp riêng rẽ, BT lệch tâm. + - P5 KL nhỏ, có màu đỏ hồng, khả năng di động nhanh, đường kính khoảng 2mm.
Hình cầu, có kích thước lớn.
- -
P6
KL to, màu trắng sữa, mọc tỏa ra như lông chim, viền hơi mờ, đường kính khoảng 6mm.
Hình que, xếp riêng rẽ, BT hình
trứng. + -
P7
KL có màu kem, bề mặt sần sùi, bám chặt vào mặt thạch, có hình thành vòng mờ xung quanh KL, đường kính khoảng 4mm. Hình que, xếp đơn hay xếp chuỗi, BT lệch tâm. + - P8 KL màu vàng nhạt, phẳng, trơn, có nhầy nhớt, đường kính khoảng 3mm. Hình bầu dục, không hình thành BT. - - P9 KL có hình trứng, trắng sữa, có nhiều vòng tròn đồng tâm, đường kính khoảng 3 mm.
Hình que, xếp thành chuỗi, BT
lệch tâm. + -
Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được
chủng độc P10
KL tròn, trắng sữa, viền có gờ nổi lên, ở giữa KL lõm xuống, đường kính 3 – 4 mm.
Hình que, ngắn,
nhỏ, BT chính tâm. + -
P11
KL có hình dạng bất định, không đều màu, xung quanh KL có vòng mờ, đường kính khoảng 2 mm.
Hình thoi, đứng riêng rẽ.
- -
P12
KL màu trắng trong, dạng sợi li ti, có nhiều thùy nhỏ, bám chặt vào bề mặt thạch, đường kính 4mm. Hình que, xếp thành chuỗi, BT lệch tâm. + - P13
KL tròn, viền nhăn, màu trắng sữa, có tâm, bề mặt gồ ghề, đường kính 8 – 10 mm. Hình que, xếp riêng rẽ, BT lệch tâm. + - P14 Tương tự KL chủng P3 nhưng viền lan ra xung quanh, đường kính 5 – 6 mm.
Hình que, đầu hơi tù, BT chính tâm. + + P15 Tương tự KL chủng P13 nhưng viền tròn, bề mặt nhẵn, có khả năng di động, đường kính 5mm. Hình que, xếp riêng rẽ, BT lệch tâm. + - P16
KL có màu trắng kem, viền nhăn, bề mặt nhẵn, đường kính khoảng 4mm.
Hình que, BT
chính tâm. + -
Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được Ký
hiệu Hình thái KL Hình thái TB BT
Tinh thể
P17 KL có hình sao, trắng trong, bề mặt gồ ghề, đường kính 4 – 6 mm. Que, BT hình trứng, lệch tâm. + - P18 KL có màu xám trắng, bề mặt hơi nhầy nhớt, ở giữa có núm nhỏ, đường kính khoảng 5 mm. Hình bầu dục, xếp thành chuỗi. - - P19 Tương tự KL chủng P3 nhưng viền ngoài mờ, lan tỏa nhiều, đường kính 5 – 6 mm.
Hình que, đầu hơi tù, xếp riêng rẽ, BT
chính tâm. + +
P20
Hình tròn, ướt, vàng nhạt, mép nhăn, có nhầy nhớt, bám chặt vào bề mặt thạch, đường kính 5 mm. Hình cầu, bắt màu đậm, xếp riêng rẽ. - - P21 Tương tự KL chủng P8 nhưng không có vòng đồng tâm, đường kính 5 – 6 mm. Hình bầu dục, không hình thành BT. - - P22 Tương tự KL chủng P13 nhưng bề mặt nhẵn, đường kính 7 – 8 mm. Hình que, xếp riêng rẽ, BT lệch tâm. + - P23 KL khô, ghồ ghề, vàng cam, mép răng cưa, không đều, có nhiều vòng tròn đồng tâm, đường kính 3 – 4 mm.
Hình cầu, không hình thành BT.
- -
Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được Ký hiệu chủng Hình thái KL Hình thái TB BT Tinh thể độc
trắng trong, mép gợn sóng, bám chặt vào bề mặt thạch, đường kính 3 – 4 mm. thành chuỗi, BT hình trứng, ngay tâm. P25 KL màu trắng kem, hình trứng, mép răng cưa, có vòng mờ xung quanh KL, đường kính 5mm. Hình que, xếp riêng rẽ hay thành chuỗi. + - P26 Tương tự KL chủng P16 nhưng viền tròn, bề mặt nhẵn, đường kính 8 – 10 mm. Hình que, BT chính tâm. + - P27
KL có bề mặt ướt, màu trắng kem, viền hơi mờ, bám vào mặt thạch, đường kính khoảng 10 mm. Hình que, xếp riêng rẽ, BT lệch tâm. + - P28 Tương tự KL chủng P3 nhưng viền tròn hơn, màu trắng sữa, đường kính 5 – 6 mm.
Hình que, hai đầu hơi tù, BT hình bầu dục, chính tâm.
+ +
Ghi chú: + (kết quả dương tính); - (kết quả âm tính).
Kết quả cho thấy trong số 28 chủng VK phân lập có: 20/28 chủng TB có dạng que, hình thành bào tử.
4/28 chủng quan sát thấy có sự hiện diện của tinh thể độc (P3, P14, P19, P28).
Căn cứ vào các đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu, đối chiếu với các đặc điểm trong khóa phân loại của Bergey (2004), chúng tôi có thể kết luận, 20 trong số 28 chủng thuộc chi Bacillus, trong đó có 4 chủng có tinh thể độc.
3.2. Khảo sát hoạt tính diệt sâu của các chủng VK có tinh thể độc
Để thử hoạt tính diệt sâu của các chủng VK phân lập được, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 4 chủng VK có sự hiện diện của tinh thể độc (P3, P14, P19, P28) trên môi trường H de Barjac ở
(a) (b)
Hình 3.1. Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng P3 (x100)
(a) (b)
Hình 3.2. Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng P14 (x100)
(a) (b)
Hình 3.3. Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng P19 (x100)
(a) (b)
300C, lắc 220 vòng/phút trong 40 h. Sau đó, tiến hành xác định số lượng BT, tinh thểvà thử hoạt tính trên sâu tơ (Plutella xylostella).
3.2.1. Kết quả xác định số lượng BT, tinh thể
Để xác định số lượng bào tử chúng tôi tiến hành xử lý mẫu ở 70oC trong 10 phút rồi pha loãng mẫu. Lấy 0,1ml cấy gạt vào các đĩa thạch vô trùng chứa môi trường thạch T3. Để vào tủ ấm ở 28o
C trong 24 h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số lượng BT, tinh thể /ml dịch lên men STT Ký hiệu chủng Số lượng bào tử (x10
9 ) /ml dịch lên men 1 P3 1,98a ± 0,03 2 P14 2,21b ± 0,03 3 P19 1,52c ± 0,04 4 P28 1,70d ± 0,06
(a, b, c, d: chỉ sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê)
Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.5 bên dưới cho thấy, trong 4 chủng VK nghiên cứu, chủng P14 có tốc độ sinh trưởng nhanh nên cho số lượng BT và tinh thể cao nhất so với các chủng còn lại. Mỗi tế bào của các chủng VK khi bị phá vỡ sẽ giải phóng ra một BT và một tinh thể độc. Vì vậy, bằng cách đếm số lượng BT ta có thể ước tính số lượng tinh thể độc có trong dịch lên men, cũng như theo dõi được tốc độ sinh trưởng của chủng VK đang sử dụng.
Hình 3.5. Biểu đồ số lượng BT/ml dịch lên men của các chủng VK có tinh thể độc
3.2.2. Kết quả hoạt lực diệt sâu
Để tiến hành thử nghiệm hoạt lực diệt sâu, chúng tôi tiến hành pha loãng dịch lên men của 4 chủng (P3, P14, P19, P28) đạt đến nồng độ 109 BT/ml. Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu được bố trí trong các đĩa Petri, mỗi đĩa 10 con sâu (tương đối đồng đều về kích thước, tuổi). Kết quả xác định hoạt lực diệt sâu ở các thời điểm sau 24 h, 48 h và 72 h (tính theo công thức Abbott) được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hoạt lực diệt sâu của các chủng VK nghiên cứu STT Ký hiệu chủng Tỷ lệ sâu chết (%) 24 h 48 h 72 h 1 P3 36,67a 74,81a 95,23a 2 P14 53,33b 78,88a 100,00a 3 P19 3,33c 13,33b 38,69b 4 P28 26,67a 57,03c 77,38c
Hình 3.6. Biểu đồ hoạt lực diệt sâu của các chủng VK nghiên cứu
Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.2 cho thấy, cả 4 chủng VK nghiên cứu đều có hoạt lực diệt sâu. Trong đó:
Ở mốc thời gian 24 h, chủng P14 có hoạt lực diệt sâu mạnh nhất, tỉ lệ sâu chết khoảng 53,33%. Các chủng còn lại cũng có hoạt lực diệt sâu, nhưng tỉ lệ sâu chết không cao. Trong đó, chủng P19 có tỉ lệ sâu chết thấp nhất, chỉ đạt 3,33%.
Ở mốc thời gian 48 h, hoạt lực diệt sâu của các chủng VK nghiên cứu tăng lên rõ rệt. Trong đó, chủng P3 có tỉ lệ sâu chết tăng nhanh nhất (74,81%). Tuy nhiên, chủng P14 vẫn cho hoạt lực diệt sâu mạnh hơn các chủng còn lại.
Ở mốc thời gian 72 h, tỉ lệ sâu chết ở nghiệm thức của chủng P14 đạt 100%. Các chủng P3 và P28 có tỉ lệ sâu chết trên 75%. Chủng P19 vẫn là chủng có hoạt lực diệt sâu yếu nhất (<50%).
Như vậy, sau khi thử nghiệm hoạt lực diệt sâu, có thể kết luận rằng chủng P14 có hoạt lực diệt sâu mạnh nhất trong 4 chủng. Điều này có thể được giải thích do chủng P14 sinh trưởng nhanh, tạo số lượng BT, tinh thể nhiều hơn các chủng còn lại.
Sự khác biệt giữa các chủng có ý nghĩa về mặt thống kê. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng P14 đi sâu nghiên cứu và định danh đến loài bằng sinh học phân tử.
Theo nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Lê Thị Minh Thành, Ngô Đình Bính, Dương Văn Hợp (2008), các chủng VK có tinh thể độc phân lập tại Vườn quốc gia Cát Bà đều cho hoạt tính diệt sâu cao từ 81% - 100% sau 72 h.
Theo nhóm tác giả Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy Kháng (2003), các chủng VK có tinh thể độc phân lập được đều cho hoạt tính diệt sâu cao từ 90% - 100% sau 72 h.
Hình 3.7. Hoạt lực diệt sâu của chủng P14 sau
24h
Hình 3.8. Hoạt lực diệt sâu của chủng P14 sau
48h
Hình 3.9. Hoạt lực diệt sâu của chủng P14 sau
72h
Hình 3.10. Hoạt lực diệt sâu của chủng P3sau
24h
Hình 3.11. Hoạt lực diệt sâu của chủng P3 sau
48h
Hình 3.12. Hoạt lực diệt sâu của chủng P3 sau
72h
Hình 3.13. Hoạt lực diệt sâu của chủng P19 sau
24h
Hình 3.14. Hoạt lực diệt sâu của chủng P19 sau
48h
Hình 3.15. Hoạt lực diệt sâu của chủng P19 sau
3.3. Định danh bằng sinh học phân tử chủng P14
Để định danh, chúng tôi gửi chủng P14 đến công ty xét nghiệm Nam Khoa giải trình tự gen 16S rRNA, kết quả như sau:
TCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC AGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGTGGGTAAC CTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTT TGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACC CGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAG CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA GTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA ACTACGTGCCAGCA
So sánh với ngân hàng gen NCBI, trình tự gen 16S rRNA của chủng P14 có độ tương đồng 99% với loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Kết luận chủng P14 thuộc loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki.
Chúng tôi gọi chủng VK phân lập được là Btk14.
3.4. Đặc điểm sinh học của chủng đã tuyển chọn
• Quan sát đại thể
Trên môi trường T3 đặc, sau 24 h nuôi cấy, chủng Btk14 tạo thành những KL hơi tròn, đường kính khoảng 5mm. Mặt trên KL có màu trắng kem, nhìn nghiêng bề mặt hơi sần sùi, có
Hình 3.16. Hoạt lực diệt sâu của chủng P28 sau
24h
Hình 3.17. Hoạt lực diệt sâu của chủng P28 sau
48h
Hình 3.18. Hoạt lực diệt sâu của chủng P28 sau
núm nhỏ ở tâm. Mép KL màu trắng, lan tỏa ra xung quanh. Mặt dưới của KL phẳng, có màu trắng kem.
• Quan sát vi thể
Sau 1 ngày nuôi cấy trên môi trường T3, tiến hành nhuộm Gram, quan sát hình thái TB dưới KHV ở độ phóng đại x 1000. Để quan sát hình dạng bào tử, sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành chụp ảnh dưới KHV điện tử quét tại Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam. Chủng Btk14 có hình thái TB dạng hình que, hai đầu tù, bắt màu với thuốc nhuộm tím gentian. Bào tử hình trứng, chính tâm của tế bào. Tinh thể có hình quả trám.
Hình 3.19. Hình thái KL chủng Btk14
(mặt trên)
Hình 3.20. Hình thái KL chủng Btk14 (mặt dưới)
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+
và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử, tinh thể độc
3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mg2+đến khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử, tinh thể độc bào tử, tinh thể độc
Theo Lucas và cộng sự (2001), Yin và cộng sự (2010), Mg2+ là ion kim loại có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein của sinh vật nhân sơ. Sự có mặt của Mg2+ ở nồng độ thấp có thể làm tăng hiệu quả dịch mã.
Theo Zhang và cộng sự (2005, 2006), Soberon và cộng sự (2009), Port và cộng sự (2011), Mg2+liên quan đến hoạt động của nội độc tố, kích hoạt 3 miền của nội độc tố gắn với thụ thể trên tế bào chủ. Vì vậy, chúng tôi bổ sung Mg2+(dưới dạng muối MgSO4) là yếu tố thử nghiệm nhằm làm tăng hoạt lực của chủng Bt.
Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của Mg2+, chúng tôi bổ sung MgSO4 vào môi trường H de Barjac với nồng độ lần lượt là 0,001 mM; 0,005mM; 0,01mM; 0,015mM; 0,02mM. Tiến hành nuôi cấy chủng VK ở nhiệt độ 30oC/ 40 h. Sau đó, kiểm tra sự sinh trưởng bằng cách đo OD (660nm), xác định số lượng BT, tinh thể và thử hoạt lực diệt sâu. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Mg2+đến khả năng sinh trưởng và hình thành tinh thể độc Nồng độ Mg2+ (mM) Sinh trưởng (OD 660nm) Số lượng BT, tinh thể (x109) /ml dịch lên men Đối chứng 2,238a± 0,05 2,15a± 0,06 0,005 2,598b± 0,02 2,55b± 0,09 0,01 2,560c± 0,05 2,55b± 0,07 0,015 2,577a± 0,02 2,52bc± 0,06 Hình 3.21. Hình thái TB của chủng Btk14 phân lập Hình 3.22. Hình dạng tinh thể độc của chủng Btk14 phân lập. (chụp dưới
kính hiển vị điện tử quét – Viện hàn lâm Khoa học Việt Nam, Tp.HCM)
0,02 2,504d± 0,01 2,42c± 0,05
Hình 3.23. Đồ thị ảnh hưởng Mg2+đến khả năng sinh trưởng của chủng Btk14
Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung Mg2+vào môi trường nuôi cấy thì sự sinh trưởng tăng lên rõ rệt (OD 660= 2,598, ở nồng độ 0,005mM) so với nghiệm thức không bổ sung thêm Mg2+ (OD 660 = 2,238). Có thể nói, Mg2+là một yếu tố rất cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh BT, tinh thể của chủng Bt nghiên cứu. Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, khi bổ sung Mg2+ở các nồng độ từ 0,005mM đến 0,02mM sự sinh trưởng, sinh BT và tinh thể độc tương đối ổn định. Tuy nhiên, có thể thấy ở nồng độ 0,005 mM chủng nghiên cứu sinh trưởng mạnh và có số lượng BT, tinh thể nhiều nhất.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Mai Thị Hằng và cộng sự (2005). Khi nhóm tác giả này nghiên cứu về ảnh hưởng của ion Mg2+ đến sự sinh trưởng và hoạt lực diệt muỗi của các chủng Bt phân lập từ RNM, cũng thấy rằng ở nồng độ Mg2+ là 0,005 mM thì sự sinh trưởng và hoạt lực diệt muỗi đạt kết quả tốt nhất.
Như vậy, có thể bổ sung Mg2+vào môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao hoạt tính của Bt với sâu hại và tốt nhất ở nồng độ 0,005 mM.
3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mn2+đến khả năng sinh trưởng và hình thành BT, tinh thể độc
Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của Mn2+, chúng tôi bổ sung MgCl2vào môi trường H