L ỜI CẢM ƠN
6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt
2.2.5.1. Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc
Dựa trên khả năng bắt màu của TB chất và màng TB với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương.
Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm.
Cách tiến hành
Làm vết bôi với VK nuôi cấy từ 16 – 24 h trên ống thạch nghiêng. Để vết bôi khô tự nhiên hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn.
Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.
Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút. Nhuộm lugol trong 1 phút.
Rửa bằng nước cất.
Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến khi tan hết màu. Rửa bằng nước cất.
Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây.
Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100.
Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dương sẽ bắt màu tím. [24]
2.2.5.2. Nghiên cứu đặc điểm bào tử và tinh thể
Nguyên tắc:
Coomassie brilliant blue có khả năng tạo phức chất với protein.
Tế bào và tinh thể đều có thành phần cấu tạo từ protein. Vì vậy, có thể nhận biết TB, BT và tinh thể thông qua độ bắt màu với thuốc nhuộm này.
Cách tiến hành
Dùng que cấy vô trùng lấy một phần KL mọc riêng rẽ trên ống thạch nghiêng hòa vào giọt nước.
Dàn đều, để khô tự nhiên. Hơ phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi. Nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue trong 3 phút để khô tự nhiên. Quan sát hình thái tế bào, BT, tinh thể dưới vật kính dầu.
Đọc kết quả: BT không bắt màu, trong suốt; tinh thể bắt màu xanh; TB bắt màu xanh. [43]