1.2.1.1. Cấu trúc và chức năng của cystatin C
Cystatin C được Butler và Flynn phát hiện tình cờ lần đầu tiên năm 1961, khi điện di protein nước tiểu của bệnh nhân thấy dấu hiệu của một protein mới đi theo sau γ protein trên băng giấy ghi kết quả điện di, protein
13
mới xuất hiện ở 79% bệnh nhân có tổn thương ống thận và trên cả điện di 2 chiều [37],[58]. Đến năm 1982, công thức hóa học của cystatin Cđược mô tả đầy đủ, chức năng của nó cũng dần được sáng tỏ [61].
Cystatin C là một protein gồm 120 acid amin, trọng lượng phân tử nhỏ 13 kDa. Cấu trúc không gian 3 chiều của cystatin C tạo bởi các liên kết di- sulphua, kích thước của cystatin C tương ứng: 30 x 30 x 50 A0[20],[58],[61].
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của cystatin C
Nguồn: theo Grubb A. (2011) [58]
Cystatin C được sản sinh ở tất cả các tế bào có nhân với mức độ tương đối hằng định với mỗi loại tế bào, vai trò sinh học của cystatin C là ức chế hoạt động của enzym cystein protease, là một enzym phân cắt polypeptid rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa của các tế bào có nhân, gần đây cystatin C còn được phát hiện ra có khả năng ức chế các enzym khác cùng họ với cystein protease. Chức năng sinh lý của cystatin C chưa được hiểu biết đầy đủ, có xu hướng bảo vệ cơ thể, ngăn chặn quá trình phá hủy mô liên kết bởi các men ly giải từ các tế bào chết hoặc các tế bào ác tính tiết ra [58],[61].
1.2.1.2. Nguồn gốc tổng hợp,giải phóng và chuyển hóa cystatin C
Cấu trúc của gen mã hóa cystatin C được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 20. Cấu trúc của gen này bao gồm 3 đoạn exon xen kẽ 2 đoạn intron. Gen này được cho rằng đóng vai trò kiểm soát nội chứng trong cơ thể (housekeeping gene), điều đó giải thích quá trình sản xuất protein trong tất cả
14
các tế bào với tốc độ hằng định. Các nghiên cứu hóa mô miễn dịch cũng khẳng định rằng cystatn C có mặt và được tiết ra ở tất cả các loại tế bào nhưng mức độ sản xuất khác nhau với các loại mô và tế bào [20], [55].
Cystatin C được giải phóng từ các tế bào có nhân sẽđược lọc tự do qua cầu thận và được tái hấp thu và chuyển hóa tại ống thận [42],[61],[114]. Năm 1996, Tenstad O và cộng sự đã nghiên cứu độ thanh thải cystatin C người trên chuột bằng cách tiêm trực tiếp cystatin C lấy từ người vào tĩnh mạch chuột, đồng thời đo mức lọc cầu thận bằng độ thanh thải 51Cr-EDTA (là chất chuNn đánh giá mức lọc cầu thận trong thực nghiệm) [58],[127]. Kết quả cho thấy độ thanh thải của cystatin C bằng độ thanh thải 51Cr-EDTA, khi kẹp động mạch chủ phía trên động mạch thận ở chuột làm giảm mức lọc cầu thận đo bằng độ thanh thải 51Cr-EDTA, MLCT ước lượng bằng cystatin C cũng giảm tương ứng,có tương quan chặt chẽđộ thanh thải 51Cr-EDTA với hệ số r là 0,99. Điều đó có nghĩa rằng cystatin C được lọc một cách tự do qua cầu thận.
thời gian (phút)
Biểu đồ 1.1: Tương quan độ thanh thải 125I cystatin C (●) với
51
Cr-EDTA (□) và 131I-apratinin (▼) sau khi tiêm vào tĩnh mạch chuột
Nguồn: Grubb A. (2011) [58]
Nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng hơn 99% cystatin C được hấp thu và thoái giáng tại ống thận. Nghiên cứu bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trên người Jacobsson B. (1995) cũng cho kết quả tương tự, cystatin C được thoái giáng tại ống thận sau khi chúng được lọc qua cầu thận, không hấp thụ ngược vào máu [69]. Nghiên cứu của Kaseda R. (2007), Christensen (2012) cho thấy cystatin C được tái hấp thu bằng cách gắn vào phân tử megalin ở bề mặt vi
15
nhung mao ống thận, megalin là glycoprotein thuộc nhóm các thụ cảm thể gắn với lipoprotein trọng lượng phân tử thấp tham gia chuyển hóa protein xuất hiện ở lòng ống thận, trong đó có cystatin C [42], [72].
Sơđồ 1.4: Tái hấp thu albumin, cystatin C bởi phân tử megalin tại ống thận
Nguồn: theo Christensen E.I. (2012) [42]
Như vậy, cystatin C là một chất nội sinh có đủ điều kiện của chất chỉ điểm dùng để ước lượng mức lọc cầu thận.
1.2.1.3. Nguyên lý định lượng
Nguyên lý định lượng cystatin C phát triển cùng với sự phát triển của các phương pháp định lượng protein trong dịch tổ chức. Nguyên lý chung nhất đó là dùng thuốc thử chứa kháng thể đặc hiệu của cystatin C người (được tạo ra khi tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể trên động vật) tạo phức hợp với phân tử cystatin C, sau đó dùng các chất chỉ thị khác nhau để phát hiện sự có mặt của phức hợp kháng nguyên – kháng thể chứa cystatin C.
+ Phương pháp đầu tiên được áp dụng là phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA: Radial Immuno Assay): dùng chất phóng xạ gắn với kháng thể mẫu, đo độ tập trung của chất phóng xạđể tính nồng độ cystatin C [82].
+ Phương pháp miễn dịch đo độ đục (PETIA: particle-enhanced turbidimetric immunoassay): thuốc thử chứa kháng thể đặc hiệu kháng cystatin C đưa vào phản ứng với mẫu, đo mức độ hấp phụ ánh sáng của mẫu
16
tương ứng sự biến đổi độ đục, dựa vào đường chuNn để tính toán giá trị xét nghiệm. Ngày nay, phương pháp này đã được hoàn thiện, tự động hóa, và được áp dụng rộng rãi nhất trên thế giới [25],[125],[139].
+ Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay): đưa mẫu đã được pha loãng kết hợp với kháng thể kháng cystatin C có sẵn trong giếng xét nghiệm, chất tạo màu được đưa vào gắn với phức hợp KN-KT, đo mức độ hấp phụ ánh sáng bằng máy đọc ELISA, giá trị xét nghiệm được tính dựa vào đường chuNn, đây là phương pháp có thể định lượng mẫu có nồng độ cystatin C thấp, thường áp dụng định lượng nồng độ trong nước tiểu [130].
+ Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang: đây là phương pháp mới, có độ chính xác cao, giá thành đắt nên chưa được áp dụng rộng rãi [89].
1.2.1.4. Ý nghĩa sinh học và các yếu tốảnh hưởng
Cystatin C được giải phóng ra từ tất cả các tế bào có nhân với tốc độ tương đối hằng định, tuy nhiên, chuyển hóa của các tế bào bình thường cũng chịu ảnh hưởng bởi tuổi, giới, chủng tộc nên tốc độ giải phóng cystatin C ở từng cơ thể có thể có sự thay đổi nhất định.
Groesbeck D (2008) nghiên cứu trên 719 người khỏe mạnh ở lứa tuổi thanh thiếu niên thấy nồng độ trung bình cysatin C huyết thanh là 0,84 mg/l, giảm đi theo lứa tuổi từ 12–19, ở nam cao hơn ở nữ, điều này ngược lại so với creatinin huyết thanh [57]. Al Wakeel J.S (2008) nghiên cứu trên người trưởng thành thấy rằng nồng độ trung bình 0,751 ± 0,11 mg/l, tăng dần theo tuổi [22]. Odden M.C. và cộng sự (2010) phân tích trên 18.000 người trưởng thành và cao tuổi thấy rằng có mối liên quan tuyến tính chặt chẽ giữa tuổi với nồng độ cystatin C huyết thanh, giá trị trung bình nồng độ cystatin C huyết thanh ở nhóm tuổi trên 80 cao hơn 46% so với tuổi dưới 40 [97]. Như vậy, ở người bình thường nồng độ cystatin C huyết thanh cao ở trẻ nhỏ, tương ứng tốc độ phát triển nhanh về thể chất, giảm dần đến tuổi trưởng thành, khi ngoài 40 tuổi, nồng độ cystatin C có xu hướng tăng lên.
17
Tình trạnh bệnh lý hoặc một số thuốc ảnh hưởng đến chuyển hóa tế bào có thể làm biến đổi nồng độ cystatin C huyết thanh. Biến đổi chức năng tuyến giáp có thể ảnh hưởng tới nồng độ cystatin C huyết thanh. Nghiên cứu của Fricker M. (2003) và Stojanoski S (2011) trên những trường hợp có cường giáp hoặc suy giáp thấy rằng cường giáp là yếu tố làm tăng nồng độ cystatin C huyết thanh và nhược giáp gây tác dụng ngược lại, khi điều trị cường chức năng tuyến giáp bằng kháng giáp tổng hợp hoặc điều trị suy giáp bằng hormon giáp cho thấy biến đổi theo chiều ngược lại [53], [124]. Tuy nhiên một số nghiên cứu lại cho kết quả không hoàn toàn phù hợp. Bokenkamp A. và cộng sự (2002) nghiên cứu trên nhóm 12 bệnh nhân hội chứng thận hư điều trị tấn công bằng corticosteroid thấy rằng nồng độ cystatin C sau điều trị biến đổi không có ý nghĩa so với trước điều trị [33]. Nghiên cứu của Bardi E và cộng sự (2010) trên 17 bệnh nhân xuất huyết giảm tiểu cầu nguyên phát và 18 bệnh nhân u lympho cấp tính có sử dụng corticoid liều cao, nghiên cứu Silva M.V và cộng sự (2011) nghiên cứu ở 42 BN lupus ban đỏ hệ thống cũng cho kết quả tương tự [28], [121]. Corticosteroid liều cao có thể có ảnh hưởng đến nồng độ cystatin C ở BN điều trị nhưng sự biến đổi là không nhiều hoặc có thể hiệu chỉnh bởi hiệu quả điều trị làm cải thiện chức năng thận.
Cystatin C là protein có trọng lượng phân tử nhỏ, sau khi lọc qua cầu thận, cystatin C được tái hấp thu và chuyển hóa gần như hoàn toàn tại ống thận, ở người khỏe mạnh nồng độ cystatin C trong nước tiểu rất thấp. Theo nghiên cứu của Uchida K và Gotoh A (2002) nồng độ cystatin C trong nước tiểu trung bình ở người bình thường là 66,4 ± 4,7 µg/l [130]. Nghiên cứu tại các thời điểm trong ngày cho thấy nồng độ cystatin C trong nước tiểu ít thay đổi (biểu đồ 1.2), nồng độ cystatin C trong nước tiểu ở người khỏe mạnh trung bình là 79 ± 5 µg/l [52].
18
Biểu đồ 1.2: Nồng độ cystatin C trong nước tiểu ở các thời điểm trong ngày
Nguồn: theo Franciotta D., Avolio C. (2005) [52]
Tóm lại, nồng độ cystatin C trong máu và trong nước tiểu ở người khỏe mạnh luôn ổn định. Nồng độ cystatin C trong nước tiểu ở người khỏe mạnh rất nhỏ (60 – 90 µg/l). Các yếu tố tuổi, giới, chủng tộc và tình trạng bệnh lý đôi khi có thể gây ảnh hưởng ít nhiều tới nồng độ cystatin C.