Nguồn: theo Grubb A. (2011) [58]
Cystatin C được sản sinh ở tất cả các tế bào có nhân với mức độ tương đối hằng định với mỗi loại tế bào, vai trò sinh học của cystatin C là ức chế hoạt động của enzym cystein protease, là một enzym phân cắt polypeptid rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa của các tế bào có nhân, gần đây cystatin C còn được phát hiện ra có khả năng ức chế các enzym khác cùng họ với cystein protease. Chức năng sinh lý của cystatin C chưa được hiểu biết đầy đủ, có xu hướng bảo vệ cơ thể, ngăn chặn quá trình phá hủy mô liên kết bởi các men ly giải từ các tế bào chết hoặc các tế bào ác tính tiết ra [58],[61].
1.2.1.2. Nguồn gốc tổng hợp,giải phóng và chuyển hóa cystatin C
Cấu trúc của gen mã hóa cystatin C được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 20. Cấu trúc của gen này bao gồm 3 đoạn exon xen kẽ 2 đoạn intron. Gen này được cho rằng đóng vai trò kiểm soát nội chứng trong cơ thể (housekeeping gene), điều đó giải thích quá trình sản xuất protein trong tất cả
14
các tế bào với tốc độ hằng định. Các nghiên cứu hóa mô miễn dịch cũng khẳng định rằng cystatn C có mặt và được tiết ra ở tất cả các loại tế bào nhưng mức độ sản xuất khác nhau với các loại mô và tế bào [20], [55].
Cystatin C được giải phóng từ các tế bào có nhân sẽđược lọc tự do qua cầu thận và được tái hấp thu và chuyển hóa tại ống thận [42],[61],[114]. Năm 1996, Tenstad O và cộng sự đã nghiên cứu độ thanh thải cystatin C người trên chuột bằng cách tiêm trực tiếp cystatin C lấy từ người vào tĩnh mạch chuột, đồng thời đo mức lọc cầu thận bằng độ thanh thải 51Cr-EDTA (là chất chuNn đánh giá mức lọc cầu thận trong thực nghiệm) [58],[127]. Kết quả cho thấy độ thanh thải của cystatin C bằng độ thanh thải 51Cr-EDTA, khi kẹp động mạch chủ phía trên động mạch thận ở chuột làm giảm mức lọc cầu thận đo bằng độ thanh thải 51Cr-EDTA, MLCT ước lượng bằng cystatin C cũng giảm tương ứng,có tương quan chặt chẽđộ thanh thải 51Cr-EDTA với hệ số r là 0,99. Điều đó có nghĩa rằng cystatin C được lọc một cách tự do qua cầu thận.
thời gian (phút)
Biểu đồ 1.1: Tương quan độ thanh thải 125I cystatin C (●) với
51
Cr-EDTA (□) và 131I-apratinin (▼) sau khi tiêm vào tĩnh mạch chuột
Nguồn: Grubb A. (2011) [58]
Nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng hơn 99% cystatin C được hấp thu và thoái giáng tại ống thận. Nghiên cứu bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trên người Jacobsson B. (1995) cũng cho kết quả tương tự, cystatin C được thoái giáng tại ống thận sau khi chúng được lọc qua cầu thận, không hấp thụ ngược vào máu [69]. Nghiên cứu của Kaseda R. (2007), Christensen (2012) cho thấy cystatin C được tái hấp thu bằng cách gắn vào phân tử megalin ở bề mặt vi
15
nhung mao ống thận, megalin là glycoprotein thuộc nhóm các thụ cảm thể gắn với lipoprotein trọng lượng phân tử thấp tham gia chuyển hóa protein xuất hiện ở lòng ống thận, trong đó có cystatin C [42], [72].
Sơđồ 1.4: Tái hấp thu albumin, cystatin C bởi phân tử megalin tại ống thận
Nguồn: theo Christensen E.I. (2012) [42]
Như vậy, cystatin C là một chất nội sinh có đủ điều kiện của chất chỉ điểm dùng để ước lượng mức lọc cầu thận.
1.2.1.3. Nguyên lý định lượng
Nguyên lý định lượng cystatin C phát triển cùng với sự phát triển của các phương pháp định lượng protein trong dịch tổ chức. Nguyên lý chung nhất đó là dùng thuốc thử chứa kháng thể đặc hiệu của cystatin C người (được tạo ra khi tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể trên động vật) tạo phức hợp với phân tử cystatin C, sau đó dùng các chất chỉ thị khác nhau để phát hiện sự có mặt của phức hợp kháng nguyên – kháng thể chứa cystatin C.
+ Phương pháp đầu tiên được áp dụng là phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA: Radial Immuno Assay): dùng chất phóng xạ gắn với kháng thể mẫu, đo độ tập trung của chất phóng xạđể tính nồng độ cystatin C [82].
+ Phương pháp miễn dịch đo độ đục (PETIA: particle-enhanced turbidimetric immunoassay): thuốc thử chứa kháng thể đặc hiệu kháng cystatin C đưa vào phản ứng với mẫu, đo mức độ hấp phụ ánh sáng của mẫu
16
tương ứng sự biến đổi độ đục, dựa vào đường chuNn để tính toán giá trị xét nghiệm. Ngày nay, phương pháp này đã được hoàn thiện, tự động hóa, và được áp dụng rộng rãi nhất trên thế giới [25],[125],[139].
+ Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay): đưa mẫu đã được pha loãng kết hợp với kháng thể kháng cystatin C có sẵn trong giếng xét nghiệm, chất tạo màu được đưa vào gắn với phức hợp KN-KT, đo mức độ hấp phụ ánh sáng bằng máy đọc ELISA, giá trị xét nghiệm được tính dựa vào đường chuNn, đây là phương pháp có thể định lượng mẫu có nồng độ cystatin C thấp, thường áp dụng định lượng nồng độ trong nước tiểu [130].
+ Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang: đây là phương pháp mới, có độ chính xác cao, giá thành đắt nên chưa được áp dụng rộng rãi [89].
1.2.1.4. Ý nghĩa sinh học và các yếu tốảnh hưởng
Cystatin C được giải phóng ra từ tất cả các tế bào có nhân với tốc độ tương đối hằng định, tuy nhiên, chuyển hóa của các tế bào bình thường cũng chịu ảnh hưởng bởi tuổi, giới, chủng tộc nên tốc độ giải phóng cystatin C ở từng cơ thể có thể có sự thay đổi nhất định.
Groesbeck D (2008) nghiên cứu trên 719 người khỏe mạnh ở lứa tuổi thanh thiếu niên thấy nồng độ trung bình cysatin C huyết thanh là 0,84 mg/l, giảm đi theo lứa tuổi từ 12–19, ở nam cao hơn ở nữ, điều này ngược lại so với creatinin huyết thanh [57]. Al Wakeel J.S (2008) nghiên cứu trên người trưởng thành thấy rằng nồng độ trung bình 0,751 ± 0,11 mg/l, tăng dần theo tuổi [22]. Odden M.C. và cộng sự (2010) phân tích trên 18.000 người trưởng thành và cao tuổi thấy rằng có mối liên quan tuyến tính chặt chẽ giữa tuổi với nồng độ cystatin C huyết thanh, giá trị trung bình nồng độ cystatin C huyết thanh ở nhóm tuổi trên 80 cao hơn 46% so với tuổi dưới 40 [97]. Như vậy, ở người bình thường nồng độ cystatin C huyết thanh cao ở trẻ nhỏ, tương ứng tốc độ phát triển nhanh về thể chất, giảm dần đến tuổi trưởng thành, khi ngoài 40 tuổi, nồng độ cystatin C có xu hướng tăng lên.
17
Tình trạnh bệnh lý hoặc một số thuốc ảnh hưởng đến chuyển hóa tế bào có thể làm biến đổi nồng độ cystatin C huyết thanh. Biến đổi chức năng tuyến giáp có thể ảnh hưởng tới nồng độ cystatin C huyết thanh. Nghiên cứu của Fricker M. (2003) và Stojanoski S (2011) trên những trường hợp có cường giáp hoặc suy giáp thấy rằng cường giáp là yếu tố làm tăng nồng độ cystatin C huyết thanh và nhược giáp gây tác dụng ngược lại, khi điều trị cường chức năng tuyến giáp bằng kháng giáp tổng hợp hoặc điều trị suy giáp bằng hormon giáp cho thấy biến đổi theo chiều ngược lại [53], [124]. Tuy nhiên một số nghiên cứu lại cho kết quả không hoàn toàn phù hợp. Bokenkamp A. và cộng sự (2002) nghiên cứu trên nhóm 12 bệnh nhân hội chứng thận hư điều trị tấn công bằng corticosteroid thấy rằng nồng độ cystatin C sau điều trị biến đổi không có ý nghĩa so với trước điều trị [33]. Nghiên cứu của Bardi E và cộng sự (2010) trên 17 bệnh nhân xuất huyết giảm tiểu cầu nguyên phát và 18 bệnh nhân u lympho cấp tính có sử dụng corticoid liều cao, nghiên cứu Silva M.V và cộng sự (2011) nghiên cứu ở 42 BN lupus ban đỏ hệ thống cũng cho kết quả tương tự [28], [121]. Corticosteroid liều cao có thể có ảnh hưởng đến nồng độ cystatin C ở BN điều trị nhưng sự biến đổi là không nhiều hoặc có thể hiệu chỉnh bởi hiệu quả điều trị làm cải thiện chức năng thận.
Cystatin C là protein có trọng lượng phân tử nhỏ, sau khi lọc qua cầu thận, cystatin C được tái hấp thu và chuyển hóa gần như hoàn toàn tại ống thận, ở người khỏe mạnh nồng độ cystatin C trong nước tiểu rất thấp. Theo nghiên cứu của Uchida K và Gotoh A (2002) nồng độ cystatin C trong nước tiểu trung bình ở người bình thường là 66,4 ± 4,7 µg/l [130]. Nghiên cứu tại các thời điểm trong ngày cho thấy nồng độ cystatin C trong nước tiểu ít thay đổi (biểu đồ 1.2), nồng độ cystatin C trong nước tiểu ở người khỏe mạnh trung bình là 79 ± 5 µg/l [52].
18
Biểu đồ 1.2: Nồng độ cystatin C trong nước tiểu ở các thời điểm trong ngày
Nguồn: theo Franciotta D., Avolio C. (2005) [52]
Tóm lại, nồng độ cystatin C trong máu và trong nước tiểu ở người khỏe mạnh luôn ổn định. Nồng độ cystatin C trong nước tiểu ở người khỏe mạnh rất nhỏ (60 – 90 µg/l). Các yếu tố tuổi, giới, chủng tộc và tình trạng bệnh lý đôi khi có thể gây ảnh hưởng ít nhiều tới nồng độ cystatin C.
1.2.2. Cystatin C với vai trò chất chỉđiểm sinh học trong bệnh thận
1.2.2.1. Cystatin C đểước lượng mức lọc cầu thận
Đánh giá chức năng thận chúng ta dựa vào mức lọc cầu thận, mức lọc cầu thận không đo được trực tiếp mà phải đánh giá gián tiếp qua độ thanh thải một chất thỏa mãn điều kiện được lọc tự do qua cầu thận và không bài tiết thêm hoặc tái hấp thu trở về máu. Phương pháp đánh giá MLCT bằng độ thanh thải các chất ngoại sinh tiêm vào cơ thể như inulin hay hoạt độ các chất phóng xạ thải qua thận (51Cr-EDTA, iohexol, 125I-iothalamate, 99mTc- DTPA) được coi là tiêu chuNn vàng, tuy nhiên các kỹ thuật này không áp dụng được rộng rãi trong lâm sàng [30] [122]. Do vậy, creatinin là chất nội sinh được dùng phổ biến nhất đểđánh giámức lọc cầu thận. Công thức tính hệ số thanh thải creatinin nội sinh kinh điển được sử dụng là [34]:
CCl (ml/l) =
U x V (ml/p) P
Phương pháp này có khó khăn là phải thu thập nước tiểu 24 giờ, sai số lớn trong thực hành lâm sàng do BN không tuân thủ. Do vậy, phương pháp
19
ước lượng ước lượng MLCT dựa vào nồng độ creatinin được áp dụng rộng rãi. Công thức Cockcroft-Gault lần đầu tiên được đưa ra năm 1976 [54],[119]:
GFR = (140 – tuổi(năm)) x cân nặng (kg) x 0,85 (nếu là nữ) / (0,814 x nồng độ creatinin máu (µmol/l))
Những năm đầu của thế kỷ 21, công thức thực nghiệm 4 biến MDRD (Modification of Diet in Renal Disease) được xây dựng để khắc phục một phần những hạn chếđó [34], [54]:
GFR = (mL/phút/1,73 m2) = 186 x (PCr/88,4)–1,154 x (tuổi)–0,203 x (0,742 nếu là nữ) x (1,21 nếu là người gốc Phi);
trong đó Pcr là nồng độ creatinin huyết thanh tính bằng µmol/l. Công thức này được lập thành phần mềm trên internet:
http://www.kidney.org/professionals/kdoqi/gfr_calculator.cfm
Các công thức trên được sử dụng phổ biến trong thực hành lâm sàng, là cơ sở khuyến cáo phân chia giai đoạn bệnh thận mạn tính của Hội thận Hoa Kỳ (KDOQI) cũng như của Hội thận quốc tế (KDIGO). Tuy vậy nó cũng có những hạn chế đó là phải hiệu chỉnh theo đặc điểm của đối tượng: tuổi, giới, chiều cao, cân nặng, chủng tộc, dinh dưỡng, nguyên nhân bệnh,.... Vì vậy, cần tìm kiếm chất chỉ điểm sinh học có thể thay thế và bổ sung cho creatinin giúp cho việc phân loại bệnh thận mạn tính ngày càng chính xác hơn.
Cystatin C đáp ứng được yêu cầu là chất nội sinh dùng để ước lượng MLCT, nồng độ cystatin C ít chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố nội tại của cơ thể như tuổi, giới và chủng tộc. Một công thức chung cho cả người lớn và trẻ em để ước lượng MLCT đó là: MLCT =Axcystatin CB [58], [59]. Tương tự như creatinin huyết thanh, nhiều công thức được thiết lập để ước lượng MLCT dựa vào cystatin C trên từng nhóm đối tượng khác nhau [112], [120], [122].
Công thức Stevens LA: MLCT = 76,7 x CysC – 1,19
hoặc MLCT = 127,7 x CysC-1,17 x tuổi-0,13 x (0,91nếu là nữ) x (1,06 nếu là người gốc Phi)
20
Công thức Hoek: MLCT = -4,32 + 80,35 x 1/CysC Công thứcLarsson A: MLCT = 77,24 x CysC-1,2623 Công thức Arnal: MLCT = 74,83 x CysC-1,333
Công thức của Stevens L.A. (2008) được xây dựng khi nghiên cứu MLCT với số lượng lớn 3418 bệnh nhân có bệnh thận mạn tính được hội thận học Hoa Kỳ khuyến cáo sử dụng [112], [122]:
Công thức này cũng được lập phần mềm trên internet:
http://www.kidney.org/professionals/kdoqi/gfr_calculator.cfm
Một điều thú vị mà các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng MLCT ước lượng bằng cystatin C hay creatinin huyết thanh chính xác ở mức 80 – 85% khi đem so sánh với MLCT tính bằng phương pháp chuNn (xạ hình thận, độ thanh thải inulin,...) [58]. Tuy nhiên, khi xây dựng công thức phối hợp cystatin C và creatinin huyết thanh để ước lượng MLCT lại cho độ chính xác ở mức 90 – 91% so với MLCT tính bằng phương pháp chuNn. Công thức ước lượng MLCT phối hợp cystatin C và creatinin do Stevens LA (2008) xây dựng được áp dụng rộng rãi hơn cả [58],[116], [122].
GFR = 177,6 x SCr−0,65 x CysC−0,57 x (tuổi)−0,20 x (0,80 nếu là nữ) x (1,11 nếu là người gốc Phi). Trong đó SCr là nồng độ creatinin huyết thanh, CysC là nồng độ cystatin C huyết thanh.
Năm 2013, Hội thận quốc tế (KDIGO) đã đưa công thức kết hợp cystatin C với creatinin để ước lượng MLCT vào khuyến cáo đánh giá và phân loại bệnh thận mạn tính, công thức được lập và sử dụng rộng rãi tại website của hội thận Hoa Kỳ:
http://www.kidney.org/professionals/kdoqi/gfr_calculator.cfm
Cystatin C có ưu điểm so với creatinin trong việc ước lượng MLCT đó là ít chịu ảnh hưởng bởi tuổi, khối lượng cơ trong cơ thể. Khi cơ thể có bệnh lý làm teo cơ như: suy dinh dưỡng, liệt, ... sẽ giảm nồng độ creatinin huyết thanh, làm sai lệch giá trị ước lượng MLCT dựa vào creatinin [58]. Mức lọc
21
cầu thận sinh lý biến đổi theo lứa tuổi ở người khỏe mạnh. Ở trẻ em nồng độ creatinin huyết thanh tăng dần từ lứa tuổi 1 tới 18 tương ứng với tốc độ tăng của khối cơ trong cơ thể, trong khi yếu tố tuổi không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng không rõ ràng tới nồng độ cystatin C huyết thanh [108]. Do vậy ở lứa tuổi nhỏ hơn 18 tuổi, MLCT ước lượng bằng cystatin C huyết thanh sẽ cho giá trị phù hợp và chính xác hơn so với creatinin huyết thanh. Ngược lại, ở người cao tuổi, mức lọc cầu thận giảm một cách sinh lý, trong khi khối lượng cơ của cơ thể cũng giảm dẫn tới nồng độ creatinin huyết thanh cũng giảm dần, khi đó MLCT ước lượng dựa vào creatinin huyết thanh phải hiệu chỉnh theo tuổiđể tương xứng với MLCT thực của người cao tuổi. Trong khi đó, ở người cao tuổi, nồng độ cystatin C huyết thanh có xu hướng tăng dần theo tuổi, mức lọc cầu thận ước lượng bằng cystatin C huyết thanh cũng sẽ giảm và tương xứng với mức lọc cầu thận thực của người cao tuổi [138]. Như vậy, xét về yếu tố tuổi, cystatin C huyết thanh có ưu thế hơn so với creatinin huyết thanh khi dùng đểước lượng mức lọc cầu thận.
1.2.2.2. Cystatin C ở bệnh nhân tổn thương thận cấp
Tổn thương thận cấp tính xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn tới suy thận cấp tính, thận bị thiếu máu trong đó sớm nhất là vùng ống thận, làm hoại tử ống thận đi kèm giảm mức lọc cầu thận ở những mức độ khác nhau. Dấu hiệu rõ ràng nhất của suy thận cấp là mất nước tiểu và tăng creatinin huyết thanh, khi đó rối loạn trên bệnh nhân đã rất nặng, ảnh hưởng đến tiên lượng chung của bệnh nhân. Do đó cần phát hiện sớm suy thận cấp để dự phòng và điều trị kịp thời, làm giảm biến chứng và tỉ lệ tử vong do suy thận cấp. Cho đến nay, ngày càng nhiều nghiên cứu sử dụng cũng như khẳng định vai trò của cystatin C trong việc phát hiện sớm tổn thương thận cấp và tiến triển đến suy thận cấp. Suy thận cấp làm giảm mức lọc cầu thận sẽ dẫn tới tình trạng tăng nồng độ cystatin C trong huyết thanh, bên cạnh đó tổn thương ống thận là tổn thương đặc hiệu và xuất hiện sớm trong tổn thương
22
thận cấp (hay suy thận cấp), tổn thương ống thận trong suy thận cấp sẽ làm giảm khả năng tái hấp thu cystatin C của ống thận, dẫn tới tăng nồng độ cystatin C trong nước tiểu [44], [102].
1.2.2.3. Cystatin C ở bệnh nhân bệnh thận mạn tính
Bệnh thận mạn tính được chNn đoán khi có dấu hiệu tổn thương thận và/hoặc suy giảm mức lọc cầu thận quá 3 tháng [74]. Để đánh giá chính xác giai đoạn bệnh thận mạn tính chúng ta phải đánh giá chính xác MLCT, làm cơ sở lựa chọn biện pháp điều trị phù hợp. Trong thực hành lâm sàng, ước lượng MLCT dựa vào creatinin là phương pháp được sử dụng rộng rãi, tuy nhiên kết