Khảo sát hoạt tính sinh học

2 Các bƣớc thực hiện

2.5 Khảo sát hoạt tính sinh học

2.5.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp DPPH, tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ - Khoa Công Nghệ - Trƣờng đại học Cần Thơ.

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do bền, màu tím. Khi gặp các chất có khả năng cho H, chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt. Đo độ hấp thu của mẫu thử ở bƣớc sóng 517 nm để xác định đƣợc % ức chế. N NO2 NO2 O2N N NH NO2 NO2 O2N N + RH + R 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine

Để khảo sát khả năng kháng oxy hóa, ngƣời ta dùng thuật ngữ: % ức chế Q và Q đƣợc tính theo công thức: 100 A A A Q 0 c 0  

Trong đó: A0: độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu (trắng mẫu). Ac: độ hấp thu của dung dịch phản ứng.

Cách xác định:

- Hòa tan tinh dầu trong DMSO ở nồng độ: 500 µg/mL. - DPPH hòa tan trong dung môi ethanol ở nồng độ 250 µM.

- Cho 8 mL dung dịch DPPH nồng độ 250 µM phản ứng với 2 mL dung dịch tinh dầu nồng độ 500 µg/mL.

- Dung dịch đƣợc lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, đem mẫu đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 517 nm. Đo ở 2 lần lặp lại.

- Độ hấp thu đo trên máy Quang phổ UV – Vis. - Tính % ức chế Q theo công thức trên.

2.5.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật [5]

a. Vi sinh vật thử nghiệm

1. Staphylococcus aureus ATCC 25923: là vi khuẩn Gram (+), hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có hình cầu, tụ thành chùm, đôi khi từng đôi hay từng tế bào đơn. Loài này sản sinh một số loại độc tố đƣờng ruột bền nhiệt, chúng không bị phân hủy khi đun ở 100oC trong khoảng 30 phút, gây các triệu chứng lâm sàng nhƣ tiêu chảy, nôn mửa. Ngoài ra, Staphylococcus aureus còn có thể xâm nhập vào da và niêm mạc, gây viêm loét da hay nội quan, nhiễm trùng máu. Sự nhiễm trùng xảy ra ở những cơ thể có sức đề kháng kém nhƣ ngƣời già yếu, trẻ còn bú hay ngƣời đang mắc bệnh tiểu đƣờng.

2. Bacillus subtilis ATCC 25923: là vi khuẩn Gram (+), thông thƣờng có trong tự nhiên, đƣợc sử dụng để khảo sát hoạt lực của các chất kháng sinh. Trong thực tế, vi khuẩn này vẫn có thể gây bệnh nhƣ nhiễm khuẩn huyết, ngộ độc thực phẩm.

3. Escherichia coli ATCC 25922: là vi khuẩn Gram (-), bình thƣờng có trong phân ngƣời khỏe mạnh và có khả năng gây tiêu chảy mãn tính hay cấp tính, nhất là ở trẻ em. Ngoài ra nó còn gây ra các bệnh nhƣ: nhiễm khuẩn đƣờng tiểu, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não. Escherichia coli tiết ra độc tố ruột, colixin, penixilinaza…

4. Salmonella typhi ty2: là trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử, vi khuẩn này là nguyên nhân gây bệnh thƣơng hàn.

5. Candida albicans: là loài nấm men nội sinh thƣờng gây ra ở niêm mạc hay da bị tổn thƣơng, đôi khi gây nhiễm trùng huyết, viêm nội mạc cơ tim và viêm màng não, là tác

nhân gây bệnh Candiadiasis hay “thrush” là một loại bệnh nấm phụ khoa ở phụ nữ và bệnh nấm miệng ở trẻ.

6. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: là vi khuẩn Gram (-), gây nhiễm khuẩn ngoài da, viêm tai ngoài, viêm xoang, viêm mắt, viêm đƣờng ruột, viêm màng não, viêm phổi.

7. Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis): là các liên cầu khuẩn Gram (+), có nguồn gốc từ phân có hình cầu hay hình oval kéo dài, thƣờng tụ tập thành từng đôi hay chuỗi, không sinh bào tử. Vi khuẩn này thƣờng gây bệnh nhiễm trùng tiểu, đặc biệt là nhiễm trùng tiểu tại bệnh viện. Enterococcus faecalis tiết ra superoxide gây một kích ứng mạnh với các tế bào miễn dịch gọi là đại thực bào. Với một số tế bào đƣờng ruột, nó còn làm thay đổi cả cách thức tăng trƣởng, phân chia và thậm chí là tăng hiệu năng của những gen liên quan đến bệnh ung thƣ.

8. NấmAspergillus Niger: có cấu tạo đa bào, tạo thành những tổ chức khác nhau nhƣ sợi khí sinh, sợi cơ chất. Sợi cơ chất của nấm mốc không đơn giản nhƣ ở xạ khuẩn mà phức tạp hơn. Ở loài Aspergillus niger có sợi cơ chất giống nhƣ rễ chùm ở thực vật gọi là rễ giả. Ở những loài nấm mốc ký sinh trên thực vật, sợi cơ chất tạo thành những cấu trúc đặc biệt gọi là vòi hút. Chúng là nấm mốc thƣờng gây bệnh hại cây trồng, làm thối rữa rau quả trong quá trình bảo quản. Trong kỹ thuật môi trƣờng, chúng đƣợc dùng làm tác nhân phân hủy rác hiệu quả. Khả năng gây bệnh của các chủng Aspergillus đang đƣợc nghiên cứu nhiều. Các sản phẩm sinh học từ chủng nấm này cũng đang đƣợc nghiên cứu và cho thấy phần nào có lợi trong chăn nuôi.

b. Phương pháp thử nghiệm

Phương pháp pha loãng liên tục trong môi trường thạch xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh kỹ thuật môi trƣờng - Khoa Môi trƣờng và Tài nguyên Thiên nhiên - Trƣờng Đại học Cần Thơ, bao gồm các chủng

Aspergillus Niger, Escherichia coli ATCC 25922.

Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococus aureus ATCC 25923, Samonella typhi Ty2 và Candida albicans ATCC 10231 do viện Pasteur thực hiện.

Chủng nấm thử nghiệm: Aspergillus Niger, môi trƣờng nuôi cấy là Potato dextrose agar (Autoclause).

Chủng vi khuẩn Gram (-) thử nghiệm: Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli), môi trƣờng nuôi cấy là Coliform agar (No autoclause).

Các bƣớc tiến hành rà MIC với chủng vi khuẩn Gram âm thử nghiệm

Escherichia coli:

Nấu thạch: Cân 8g Coliform agar cho vào 300 mL nƣớc cất, tiến hành khuấy có gia nhiệt cho đến khi Coliform agar tan đều hết trong nƣớc cất (dung dịch không còn đục). Đổ thạch: dùng ống đong đong 25mL môi trƣờng cho vào mỗi đĩa petri, sau đó cho một lƣợng tinh dầu ở các nồng độ khảo sát vào môi trƣờng lắc nhẹ cho tinh dầu phân tán đều trong môi trƣờng, thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy ở chế độ quạt để làm khô môi trƣờng.

Pha loãng mẫu: Lấy 1 mL mẫu vi sinh vật đem đi pha loãng ở nồng độ 10-4.

Cấy vi sinh vật lên đĩa vừa chuẩn bị: dùng que cấy trải đều 500 µL mẫu vi khuẩn đã pha loãng lên mặt thạch. Dùng thanh gạt (sau khi đã khử trùng) trải đều huyền dịch vi khuẩn trên bề mặt môi trƣờng. Để mẫu hấp thụ hoàn toàn vào môi trƣờng trƣớc khi mang đi ủ.

Ủ trong tủ ủ vi sinh (model BE 600) trong 2 ngày rồi quan sát kết quả: Tiến hành đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn còn sống hiện diện trong các đĩa petri bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc[2]. Trong phƣơng pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng theo dãy thập phân liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên mặt thạch với số lƣợng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối. Ngƣợc lại, số lƣợng khuẩn lạc trên đĩa quá nhỏ sẽ không có giá trị thống kê. Số lƣợng khuẩn lạc tối ƣu đƣợc đề nghị bởi các cơ quan có uy tín là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.

Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại ít nhất trên 2 đĩa. Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không nhất thiết trùng lặp với số tế bào ban đầu đƣợc đƣa lên môi trƣờng nên kết quả đếm thƣờng đƣợc trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/mL (Colony Forming Unit) thay vì số tế bào/mL.

Nồng độ tinh dầu ở mức thấp nhất mà vẫn còn khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn đƣợc gọi là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Các bƣớc tiến hành rà MIC với chủng vi khuẩn Gram dƣơng thử nghiệm

Enterococcus faecalis:

Nấu thạch: Cân 8.3g Kanamycin esculin azide agar cho vào 200 mL nƣớc cất, tiến hành khuấy có gia nhiệt cho đến khi Kanamycin esculin azide agar tan đều hết trong nƣớc cất (dung dịch không còn đục). Sau đó mang dung dịch đi khử trùng bằng máy khử trùng Hirayama autoclave Hve – 50.

Đổ thạch: dùng ống đong đong 25mL môi trƣờng cho vào mỗi đĩa petri, sau đó cho một lƣợng tinh dầu ở các nồng độ khảo sát vào môi trƣờng lắc nhẹ cho tinh dầu phân tán đều trong môi trƣờng, thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy ở chế độ quạt để làm

Pha loãng mẫu: Lấy 1 mL mẫu vi sinh vật đem đi pha loãng ở nồng độ 10-3.

Cấy vi sinh vật lên đĩa vừa chuẩn bị: dùng que cấy trải đều 1000 µL mẫu vi khuẩn đã pha loãng lên mặt thạch. Dùng thanh gạt (sau khi đã khử trùng) trải đều huyền dịch vi khuẩn trên bề mặt môi trƣờng. Để mẫu hấp thụ hoàn toàn vào môi trƣờng trƣớc khi mang đi ủ.

Ủ trong tủ ủ vi sinh (model BE 600) trong 48 giờ rồi quan sát kết quả: Tiến hành đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn còn sống hiện diện trong các đĩa petri bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc tƣơng tự nhƣ đếm số khuẩn lạc Escherichia coli.

Nồng độ tinh dầu ở mức thấp nhất mà vẫn còn khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn đƣợc gọi là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Các bƣớc tiến hành rà MIC với chủng nấm Aspergillus Niger:

Nấu thạch: Cân 16g Potato dextrose agar cho vào 400 mL nƣớc cất, tiến hành khuấy có gia nhiệt cho đến khi Potato dextrose agar tan đều hết trong nƣớc cất (dung dịch không còn đục). Sau đó mang dung dịch đi khử trùng bằng máy khử trùng Hirayama autoclave Hve – 50.

Đổ thạch: dùng ống đong đong 25mL môi trƣờng cho vào mỗi đĩa petri, sau đó cho một lƣợng tinh dầu ở các nồng độ khảo sát vào môi trƣờng lắc nhẹ cho tinh dầu phân tán đều trong môi trƣờng, thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy ở chế độ quạt để làm khô môi trƣờng.

Cấy vi sinh vật lên đĩa vừa chuẩn bị: dùng que cấy trải đều 500 µL huyền dịch nấm lên mặt thạch. Dùng thanh gạt (sau khi đã khử trùng) trải đều huyền dịch nấm trên bề mặt môi trƣờng. Để mẫu hấp thụ hoàn toàn vào môi trƣờng trƣớc khi mang đi ủ.

Ủ trong tủ ủ vi sinh (model BE 500) từ 4 - 5 ngày rồi quan sát kết quả: Tiến hành đếm mật độ tế bào nấm trong các đĩa bằng buồng đếm hồng cầu trên kính hiển vi[2]. Buồng đếm hồng cầu thƣờng là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và đƣợc bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi đƣợc phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và đƣợc chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2

và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện tích 1/400 mm2.

Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5-10 tế bào nấm. Đặt một giọt mẫu đƣợc pha loãng vào vùng đếm trên buồng đếm. Chỉnh thị trƣờng của kính hiển vi sao cho một thị trƣờng chứa trọn một ô lớn (4x4 = 16 ô nhỏ). Đếm số tế bào hiện diện trong 1 ô lớn. Sau đó, chỉnh thị trƣờng tìm một ô lớn khác. Đếm số tế bào của ít nhất 5 ô lớn rồi lấy giá trị trung bình, hoặc có thể đếm số tế bào trên tất cả các ô. Cách tính mật độ tế bào nhƣ sau: thể tích của 1 ô lớn là 1/25 mm2

x 1/10 mm = 1/250 mm3 hay 1/250 x 10-3 cm3 = 4 x 10-6 mL. Nhƣ vậy, mật độ tế bào của

huyền phù mẫu là: N/mL = 0.25a x 106 tế bào/mL (trong đó a là số tế bào bình quân trong một ô lớn).

Nồng độ tinh dầu ở mức thấp nhất mà vẫn còn khả năng ức chế sự phát triển của nấm đƣợc gọi là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

2.6 Sắc ký cột trên mẫu gừng

Chiết xuất dầu gừng bằng phƣơng pháp hồi lƣu trong bộ chiết soxhlet với dung môi ethanol 96o.

Loại các tạp chất trong dầu gừng bằng cách chiết với dung môi: n-hexan; n-hexan: petro ether thu đƣợc dịch nghiên cứu.

Phân lập các cấu tử bằng sắc ký cột với chất hấp thu là silicagel và dung môi lần lƣợt là: n-hexan, ethylic ether.

Xác định cấu tử đã phân lập bằng phổ LC – MS Công ty TNHH MTV Khoa học Công nghệ Hoàn Vũ – Trung tâm Phân tích Công nghệ cao Hoàn Vũ, Quận Tân Phú – TP. Hồ Chí Minh; phổ 1H – NMR (Bruker Avance 500MHz) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3 Phối chế sản phẩm lotion

3.1 Công thức cơ sở của nền lotion

Bảng 5.1 Công thức cơ sở của nền lotion

Thành phần % Chức năng Tƣớng A (tƣớng dầu) Tween 80 Cetyl alcohol Stearic acid GMS Vaseline Isopropylmyristate 1.50  3.50 3.00 0.48 1.00  3.50 0.75 20.00 Chất nhũ hóa nonion Chất trợ nhũ hóa Giữ ẩm Chất trợ nhũ hóa Giữ ẩm Giữ ẩm, trợ dẫn truyền Tƣớng B (tƣớng nƣớc) SLES EDTA Glycerine Xanthangum Methyl parabene Propyl parabene Nƣớc cất 0.15  0.30 0.10 1.00 0.75  1.60 0.15 0.15 vđ 100 Chất nhũ hóa anion

Khóa ion kim loại Giữ ẩm Chất làm đặc Kháng khuẩn Kháng nấm Giá mang Tƣớng C (hoạt chất) Dầu gừng Tinh dầu tiêu

10 2

Hoạt chất tan mỡ Hoạt chất tan mỡ

Tƣớng D Hƣơng 0.10 Tạo hấp lực

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình phối chế

Chọn phƣơng pháp quy hoạch theo yếu tố từng thành phần. Đánh giá độ bền sản phẩm thông qua biến đổi độ nhớt. Từ công thức cơ sở, khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình phối chế. Các yếu tố khảo sát là thông số thành phần và thông số kỹ thuật. Bảng 5.2 Các thông số khảo sát

Thông số khảo sát Đơn vị Chức năng Thứ tự khảo sát Khoảng khảo sát Thông số thành phần Tween 80 GMS SLES Xanthangum % % % % Chất nhũ hóa nonion Chất trợ nhũ hóa Chất nhũ hóa anion Chất làm đặc 1 2 3 4 1.50  3.50 1.00  3.50 0.15  0.30 0.75 1.60 Thông số kỹ thuật

Thời gian khuấy tạo nhũ Nhiệt độ khuấy tạo nhũ Vận tốc khuấy tạo nhũ phút oC v/ph Phối hợp tạo nhũ 5 6 7 30  90 60  85 700  1700

3.3 Quy trình phối chế

Hình 5.2 Quy trình phối chế tạo sản phẩm lotion

Cách tiến hành:

Chuẩn bị tƣớng dầu: cân chính xác khối lƣợng từng thành phần cho vào becher 100ml, đun nóng tạo hỗn hợp đồng nhất trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 70  75oC với thời gian 45 phút.

Chuẩn bị tƣớng nƣớc: cân các thành phần trong tƣớng nƣớc vào becher 250ml (trừ xanthangum), khuấy đều hỗn hợp trong thời gian 45 phút, nhiệt độ 70  75oC.

Tƣớng nƣớc Khuấy và gia nhiệt Hỗn hợp đồng nhất Tƣớng dầu Khuấy và gia nhiệt Hỗn hợp đồng nhất t = 70  75oC, T = 45 phút v = 750 vòng/phút Khuấy tạo nhũ Điều chỉnh khối lƣợng t1 = 60  85oC T1 = 30  90 phút Nƣớc nóng Hạ nhiệt từ từ (vẫn khuấy) t2 = 45oC T2 = 60 phút Hoạt chất Hƣơng Hạ về nhiệt độ phòng (vẫn khuấy) Để ổn định Sản phẩm

Khuấy tạo nhũ: cho từ từ tƣớng dầu vào tƣớng nƣớc trong thời gian 30 phút, khảo sát nhiệt độ khuấy tạo nhũ từ 60  85oC.

Ổn định nhũ: cuối quá trình tạo nhũ, cho xanthangum đã ngâm nở vào hệ. Tiếp tục khuấy ổn định nhũ rồi hạ nhiệt độ xuống còn 45oC, điều chỉnh khối lƣợng bằng cách thêm nƣớc nóng vào. Sau 15 phút, cho hoạt chất vào hệ, khuấy cho hoạt chất phân bố hoàn toàn trong nhũ. Cuối cùng, thêm hƣơng và hạ nhiệt độ dần về nhiệt độ phòng.